低聚合度褐藻寡糖的分离制备及其脂蛋白代谢影响初步研究

发布时间：2020-07-26 13:14

【摘要】：褐藻寡糖是褐藻胶的降解产物,由甘露糖醛酸(M)和古洛糖醛酸(G)构成,是一种阴离子寡糖,具有诸多生理药理学活性。通过生物降解法获得褐藻寡糖具有快速高效,反应温和等诸多优点,得到的褐藻寡糖为不饱和寡糖,具有诸多饱和寡糖不具备的生物活性。但生物降解法获得的褐藻寡糖是聚合度不一的寡糖混合物,糖基组成和寡糖活性存在较大差异,严重影响了批次稳定性及产品品质,限制了其推广应用。为此,本论文使用Isoptericola halotolerans CGMCC 5336褐藻胶裂解酶制备褐藻寡糖,经分离、纯化后得到聚合度均一的寡糖,并对其纯度、结构进行分析。在此基础上,研究了不同组分对HepG2细胞低密度脂蛋白受体(LDLR)和前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)表达水平的作用,确定了不同组分对脂蛋白代谢的影响,以期为后续应用奠定基础。主要研究工作如下:(1)使用褐藻胶裂解酶制备褐藻寡糖,经乙醇沉淀去除大分子多糖及蛋白质,命名为FrA。通过薄层色谱法(TLC)和液质联用技术(LC-MS)对其组成进行初步分析。结果表明,FrA中寡糖的聚合度为2-6,其中二、三、四糖含量较高,五、六糖含量较低。通过RT-PCR和Western Blot技术,研究了FrA对HepG2细胞中LDLR和PCSK9的基因和蛋白水平的影响,结果表明,1 mg/mL的FrA能够上调LDLR的基因及蛋白水平。并且可以下调PCSK9的基因及蛋白水平。分别通过离子交换色谱法(DEAE)和凝胶色谱法(Bio Gel P2)对FrA进行分离,最终确定使用Bio Gel P2凝胶柱进行分离纯化,共得到四个组分,分别命名为Fr1、Fr2、Fr3、Fr4。(2)通过TLC和LC-MS,对Fr1、Fr2、Fr3和Fr4进行分析;通过高效液相色谱法(HPLC)和核磁共振频谱(NMR)对Fr2、Fr3和Fr4进一步分析。结果表明Fr1中含有两种聚合度的寡糖,为五糖和六糖;Fr2、Fr3和Fr4均为聚合度均一的寡糖,分别为四糖、三糖和二糖。除Fr4外,其余两种寡糖中均存在同分异构体,Fr2中含有四种寡糖,Fr3中含有两种寡糖。经NMR分析,Fr2中寡糖为△MGG、△GGG、△GMG和△MMG;Fr3中寡糖为△GG和ΔMG;Fr4中寡糖为△G。所获得的褐藻寡糖其还原端均为古洛糖醛酸残基,说明所使用的褐藻胶裂解酶能够特异性识别G(1→4)M或G(1→4)G片段。如果将G(1→4)视为0位,(1→4)(G/M)视为1位,则当酶解片段-1位为古洛糖醛酸时,该酶活是-1位为甘露糖醛酸残基的寡糖片段的3倍。(3)对所获得的四个组分进行活性评价。研究了其对LDLR的基因和蛋白水平的调节作用以及对PCSK9蛋白水平的调节作用。结果显示,四个组分中Fr1,Fr3,Fr4均能上调LDLR的蛋白水平,其中Fr3和Fr4的活性均较为显著。Fr3能下调PCSK9的蛋白水平,故Fr3对LDLR蛋白表达水平的上调作用可能与PCSK9有关。而Fr4对LDLR的上调作用与PCSK9无关,可能受到固醇反应原件结合蛋白-2(SREBP-2)的调节。这些结果表明,Fr3和Fr4可能会上调LDLR增加对LDL-胆固醇的摄取,在降胆固醇方面具有潜在的应用价值。
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R91
【图文】：

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第一章绪论藻胶概述藻胶的结构藻胶是一种由海洋褐藻生成的阴离子多糖[1]。是由（1→4）连接的 D-甘露和其 C5 异构体 L-古洛糖醛酸（G）组成的线性聚合物，以均聚（MM 或 MG 或 GM）方式排列组成[2; 3]。主要存在三种结构片段：β-D- (1，4)连接酸片段 (Polymannuronate ， PM) ， -L-(1 ， 4) 连接的聚古洛糖醛 uluronate，PG)，G 与 M 交替共聚的片段 PMG[4]。虽然 G 与 M 仅 C5 上的，但是聚合成链后空间结构却差异巨大。甘露糖醛酸之间通过 le-4e 两个，其结构呈现出“带”状；而古洛糖醛酸则是通过 1a-4a 两个平伏键相连接现为“脊柱”状[5]，如图 1-1 所示。

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20 左右的聚糖。化学降解法具有生产成本低、技术成熟、反应机理明确环境污染较大。2）物理法。物理降解法通常用作其他方法的辅助方法，物理降解法常用声等方法。其中，超声波法的降解产物极限分子量为 50000 左右，不能获的寡糖，故不常用于制备寡糖。Aida 等通过高温降解法制备褐藻寡糖，但，生成得到的单糖易生成乳酸等有机酸[24]。相较于化学法，物理法具有操速、无环境污染等优点。3）酶解法。酶作为高效的生物催化剂，在食品、医药等各个领域内被广法因其反应温和、操作简便，被广泛应用于寡糖的制备。多糖裂解酶是降工具酶。例如，多糖水解酶用于降解中性多糖，多糖水解酶和裂解酶可降[25]。多糖裂解酶用于降低多糖的分子量生成具有不同聚合度的寡糖，其聚到 5，并且聚合度不同的寡糖具有不同的生物活性[26-28]。褐藻胶裂解酶通藻胶中的（1→4）糖苷键断裂而制备寡糖。生成寡糖在非还原端的 C4，键，如图 1-2。所生成的不饱和低聚寡糖在紫外区域 230 nm-240 nm 处有; 30]。同时，生成的不饱和寡糖具有与饱和寡糖不同的生理活性。

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图 1-3 凝胶层析原理Fig.1-3 Principle of gel chromatography丙烯酰胺凝胶是一种人工合成凝胶，用于高分辨率的凝胶过滤。是以丙烯甲叉双丙烯酰胺胶联而成，后经干燥粉碎或加工成形制成颗粒。通过控制来制备各种型号的凝胶，交联剂越多，孔隙越小，所能分离的物质的分子与分离范围如表 1-1 所示。表 1-1 主要型号及分离范围Table 1-1 Main model and separation range型号分离范围（Da）Bio-Gel P 2 100 1,800Bio-Gel P 4 800 4,000Bio-Gel P 6 1,000 6,000Bio-Gel P 10 1,500 20,000Bio-Gel P 30 2,400 40,000Bio-Gel P 60 3,000 60,000

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