Agromyces mediolanus环氧化物水解酶催化合成手性环氧化物的研究

发布时间：2020-07-25 19:26

【摘要】：手性苯基环氧乙烷(SO)和手性苄基缩水甘油醚(BGE)是合成很多药物的重要前体物。如(S)-SO可作为合成反苯环丙胺结构的原料,用于合成抗肿瘤,抗抑郁以及治疗急性冠脉综合征等药物。(R)-BGE是合成抗肿瘤药物SPIKET-P和番荔枝内酯的重要前体物,在抗白血病方面有着重要价值。(S)-BGE是很多免疫抑制剂的重要结构部分,可用于合成天然产物二乙酸隐花甘蓝。该药在治疗头痛,晨吐以及抗癌甚至在藻类信息素前体的合成等领域具有重要的研究价值。本文根据文献报道,合成了Agromyces mediolanus环氧化物水解酶(EH-Am)的基因序列,并将此基因导入大肠杆菌质粒中进行表达。通过单因素优化,得出最优表达条件:诱导剂浓度为0.2 mM,诱导温度为28℃,诱导时间为8 h。对EH-Am的酶学性质进行了研究,结果发现,此酶的最适pH为8.0,最适反应温度为35℃。温度稳定性结果显示,30℃时的半衰期为51.14 h,而50℃的半衰期为4.74 h。首先,利用EH-Am拆分外消旋SO制备手性SO。结果显示,当底物浓度为1.06 mM,反应10 h后(R)-SO的ee值99%,收率为25%。对两个构型底物之间的相互抑制以及产物抑制进行了研究,结果表明,(S)-SO能显著抑制(R)-SO的水解,(S)-SO的水解产物产物(S)-1-苯基-1,2-乙二醇对(S)-SO水解存在较强抑制。底物浓度研究结果显示,当SO浓度大于2.11 mM时,(R)-SO的ee值较低。通过底物补加的方式,(R)-SO的收率由24.8%提高到33.2%(底物浓度2.11 mM);向反应体系中加入一定量的吐温20表面活性剂,(R)-SO的收率则提高到34.2%。接着利用EH-Am拆分外消旋BGE制备手性BGE。结果显示,当底物浓度为6.72 mM,反应6 h后(S)-BGE的ee值99%,收率为34%。对两个构型底物之间的相互抑制以及产物抑制进行了研究,结果表明(R)-BGE能显著抑制(S)-BGE的水解,(R)-BGE的水解产物产物(R)-3-苄基-1,2-丙二醇对(R)-BGE水解存在较强抑制。底物浓度对(S)-BGE的ee值和产率有显著影响,当底物浓度为0.672 mM时,(S)-BGE的ee值99%,收率达40.1%。随着底物浓度的提高,(S)-BGE的收率逐渐下降。当外消旋BGE浓度为10.75 mM时,(S)-BGE的收率只有21.2%;若继续提高底物浓度,(S)-BGE的ee值则达不到99%。通过底物补加的方式,当浓度为10.75 mM时,(S)-BGE的收率为由原来的21.2%提高到26.9%;在反应体系加入一定量的表面活性剂Triton X-100,(S)-BGE的收率则提高到35.9%。
【学位授予单位】：浙江海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R91
【图文】：

环氧化物水解酶,苯基环氧乙烷,外消旋,拆分

1 环氧化物水解酶拆分外消旋苯基环氧乙烷合成手性苯基环氧乙烷nthesis of chiral phenyl epoxy ethane by resolution of racemic phenyl epith epoxide hydrolase.氧化物水解酶的作用原理化物水解酶的结构各有不同，来自动物体内和来自植物的酶的结构具。来源于哺乳动物的可溶性环氧化物水解酶和微粒体环氧化物水解酶末端区域，但其同源性非常差，而从植物里得到的环氧化物水解酶却。环氧化物水解酶的基因序列以及空间结构[36]，环氧化物水解酶一共：第一类属于 α 螺旋型，而另一种则属于 β 折叠型。环氧化物水解酶也有两个：其一是帽子结构，其二是核心结构，分别由 5 个 α 螺旋组成。根据文献报道，环氧化物水解酶的的功能结构一般是由天冬氨构成。具体的催化机制分为两个步骤，第一步天冬氨酸残基攻击含环原子，生成共价酯中间体；第二步，另一个天冬氨酸残基参与下，组

重组质粒,载体,进样量,检测波长

相检测条件[49]：安捷伦 1260 系统，(1) XDB-C18 反相柱50mm)，进样量 20 μL，流动相为乙醇/水 (75∶25)，检测波长 230℃，流速 1 mL/min；(2) CHIRALPAK AS-H 手性柱 (5 μm 4进样量 20 μL，流动相为正己烷/异丙醇 (95∶5)，检测波长 230℃，流速 1 mL/min。结果与讨论重组菌的构建载体用双酶切法切开，再将 EH-Am 基因片段嵌入载体[50]， pET28a-EH，结果如图 2-1。双酶切电泳结果如图 2-2 两个数量与载体以及基因碱基对数量相吻合，证明了重组质粒的后将载体导入受体细胞，得到重组 E.coli DE3/pET28a-EH。

酶切电泳,重组质粒,酶活,活力测定

图 2-2 重组质粒 pET28a-EH 酶切电泳图el electrophoresis of pET28a-EH treated with restriA;Lane2: Digested with NcoI/XhoI;Lane M: DNA Mark肠杆菌活力测定oli DE3/pET28a-EH 的酶活检测结果如表 2 DE3 没有检测出酶活，没有经过诱导的H 也没有检测出活力，而经过 0.2 mM 诱导剂H 的菌体检测有酶活，酶活为 5.79 U/L，说明活性。表 2-2 重组菌 E.coli DE3/pET28a-EH 酶活检

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