包含sLe~x的肿瘤糖疫苗的可行性评价与sLe~x衍生物（sLe~x-方酸乙酯）的活性研究

发布时间：2020-07-31 10:40

【摘要】：恶性肿瘤是我国居民死亡的主要原因之一,近20年来,研究者逐渐将研究重点放在肿瘤特异性免疫治疗上,即通过肿瘤疫苗来治疗肿瘤,并在这方面取得了一些进展,免疫疗法应该是目前对人体毒性伤害最小的疗法。免疫治疗主要通过两种途径抑制肿瘤:一种是在肿瘤发生过程中诱发机体产生有效的抗肿瘤免疫应答;另一种是对肿瘤进行长期监控,降低肿瘤复发的可能性,这可以通过免疫记忆实现。现在已有一些肿瘤疫苗上市,可以预见在将来,人们很有可能能通过疫苗来预防治疗肿瘤。肿瘤相关糖抗原(TACAs)是指在正常细胞与肿瘤细胞上都存在,但在表达量上有很大差异的糖抗原,它与肿瘤的转移和侵袭都有关系。唾液酸化Lewis x(sialyl Lewis x,sLex)是E、P和L-选择素这三种粘附分子的配基,多表达在胚胎组织及肿瘤细胞表面,在免疫细胞上也有少量的表达。研究表明,sLex在一些恶性上皮性肿瘤的浸润、转移过程中发挥重要作用。所以sLex是一种设计肿瘤疫苗的合适靶标,但是sLex属于TACAs,而TACAs不能引起T细胞的免疫应答,导致它并不能产生高亲和力的IgG抗体,也不能产生记忆细胞,且容易引起免疫耐受。将TACAs与蛋白载体相连接的方法可以用来提升免疫原性,使糖抗原可以被T细胞识别,引起T细胞的免疫应答。CRM197蛋白是白喉毒素(diphtheriatoxin,DTx)突变体,它没有白喉毒素的毒性,但保留了与白喉毒素相同的炎症性和免疫刺激性,这使它被广泛应用作糖结合物疫苗载体。钥孔血蓝蛋白(keyholelimpethemocyanin,KLH)来自于海洋蜗牛的血淋巴,也被广泛应用为载体蛋白,首先对比其他载体蛋白KLH能引出更强的免疫应答,这是由于其相对分子质量(Mr)大、结构较复杂造成的,其次由于KLH来源于海洋蜗牛,它在生物系统上远离哺乳动物物种,因此在测定过程中产生与哺乳动物待检测靶点样品发生交叉反应的抗体的可能性较小。本课题将sLex与重组的CRMI97蛋白或KLH蛋白相连接,合成了CRM197-sLex和KLH-sLex结合物疫苗,并对其进行了免疫学评价。同时,对与蛋白载体连接的sLex衍生物——sLex-方酸乙酯的活性进行了研究。主要研究内容与结果如下。第一部分1 CRM197蛋白的表达和纯化目的蛋白CRM197在大肠杆菌中除了以包涵体的形式大量表达,也以可溶的形式少量表达。鉴于实验用量、纯化的简便性以及纯化蛋白的稳定性考虑,主要纯化了可溶性表达的CRM197,在20℃、0.5 mmol/L异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的诱导条件下,每1 L菌液获得纯化的CRM197 7.5 mg。2糖蛋白结合物疫苗的合成及其合成效率测定以方酸二乙酯活化sLex,将sLex糖链与CRM197蛋白、KLH蛋白、牛血清白蛋白(BSA)和人血清白蛋白(HSA)进行偶联,得到的糖结合物疫苗用MALDI-TOF-MASS或硫酸一苯酚法进行分析。经计算,平均一分子CRM197的载糖率约为4%;平均一分子KLH的载糖率约为7%;平均一分子BSA的载糖率约为3%;平均一分子HSA的载糖率约为10.8%。3糖蛋白结合物疫苗的免疫学评价将合成的CRM197-sLex和KLH-sLex结合物作为疫苗对C57BL/6小鼠进行四次免疫并取得抗血清,抗血清用直接ELISA法进行抗体滴度(IgG)的分析。抗体滴度分析中,CRM197-sLex结合物免疫的抗血清可以产生更高的抗体滴度(1:72900),KLH-sLex结合物免疫的抗血清产生的抗体滴度为1:24300。用MTT法测定抗血清的补体依赖性细胞毒性作用(CDC)。用结合物疫苗免疫的小鼠产生的抗血清在补体存在的情况下,以剂量依赖型的方式对人肺癌A549细胞和鼠黑色素瘤B16-F10细胞产生较强的杀伤作用,B16-F10细胞与2 μL抗血清共孵育存活率约为40%,A549细胞与2 μL抗血清共孵育存活率约为60%。通过划横实验测定抗血清对肿瘤迁移的影响,在36和48h时抗血清对A549细胞的迁移有显著的抑制作用。通过体内抗肿瘤实验验证了 KLH-sLex结合物对肿瘤的抑制率和存活率的影响都强于PBS组,但均不如KLH组,猜想有可能是sLexProSQ的体内活性对肿瘤抑制率和小鼠存活率造成了影响。第二部分1 SLexProSQ的细胞毒性测定用MTT法测定不同浓度sLexProSQ对EA.hy926细胞、B16-F10细胞、A549细胞在不同时间点的存活率的影响。结果显示,sLexProSQ在各个浓度(0.1、0.2、0.5、1、2、4、6、8、10 μg/mL)以及所有检测时间点(6、12及24 h)都对细胞存活率没有明显的影响。2 SLexProSQ抗E-选择素粘附效应用MTT法测定不同浓度sLexProSQ与B16-F10细胞、A549细胞共孵育对E-选择素粘附效应的影响。结果显示,sLexProSQ在800μg/mL的浓度下对细胞与选择素的粘附有显著的抑制效果。3 SLexProSQ体内抗肿瘤实验研究SLexProSQ高中低三个剂量均对小鼠B16-F10黑色素瘤有一定的抑制作用,低剂量组抑制率平均为13%、中剂量组抑制率平均为59.7%、高剂量组抑制率平均为27.4%。HE染色观察组织坏死情况,给药组坏死均强于PBS组,PBS组肿瘤细胞的异型性较给药组更为严重。CD34免疫组化结果表明给药组肿瘤组织新血管生成少于PBS组,且中剂量组新血管生成最少。与Western blot做VEGFR-2条带显示结果一致。用ELISA法测定sLexProSQ不同剂量对IL-6、TNF-αα和IL-1β含量的影响,随着给药剂量的升高IL-6的含量降低,TNF-α和IL-1β的含量升高。结论和意义本研究成功合成了 CRM197-sLex和KLH-sLex结合物疫苗,并对其进行了免疫学评价。C57BL/6小鼠可以在结合物疫苗的刺激下产生较高的抗体滴度,其抗血清在体外有补体存在的情况下可以杀伤表达该抗原的肿瘤细胞,并能在体外抑制表达该抗原的肿瘤迁移,但在体内并未产生良好的抗肿瘤效果。通过对sLex衍生物的活性进行研究,体外研究发现sLexProSQ具有抑制肿瘤细胞对E-选择素的粘附,体内研究发现sLexProSQ在一定剂量下对肿瘤具有明显的抑制作用。本研究为基于sLex的糖疫苗的设计和研究提供了基础,也为sLex及其衍生物作为抗肿瘤制剂的开发提供了实验依据。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R96
【图文】：

瘤免疫方法主要包括特异性主动免疫和被动免疫及过继免疫。逡逑肿瘤的特异性主动免疫主要指的是肿瘤疫苗刺激机体产生针对肿瘤相关特逡逑异性抗原的免疫应答。癌症特异性免疫的产生需要三个步骤（图１－１），一，抗逡逑原递呈细胞（例如树突细胞［ＤＣｓ］）将癌抗原捕获并加工成抗原肽，将抗原肽表逡逑达在抗原递呈细胞表面，从而被相应Ｔ细胞的Ｔ细胞抗原受体（ＴＣＲ）识别（信逡逑号１）。二，Ｔ细胞活化需要多种细胞表面配对协同刺激分子与Ｔ细胞和抗原递逡逑呈细胞结合（信号２）。为了实现最佳的Ｔ细胞活化，信号１和２都是必需的。逡逑三，活化的特异性Ｔ细胞到达肿瘤位点并识别表达该抗原的肿瘤细胞，从而杀逡逑死癌细胞［２］。逡逑１０逡逑

ｓＬｅｘ和相关表位的表达的情况。逡逑原发肿瘤细胞首先进入循环系统，而后形成肿瘤血栓，最后与肝、肺等较远逡逑器官的内皮细胞相互作用从而完成远处转移。肿瘤转移过程如图１－２所示。逡逑逦Ｐｒｉｍａｒｙ邋ｔｕｍｏｒ逡逑Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ邋ｓｅｄｉｍｅｎｔ逡逑１１邋＾逡逑Ｔｒａｎｓｆｅｒｅｅ＂逦？逦Ｂａｓｉｌａｒ邋ｍｅｍｂｒａｎｅ＾逦Ｎ．邋＾逦Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ逡逑ｐｌａｔｅｌｅｔ邋Ｔｕｍｏｒ邋ｅｍｂｏｌｉ逡逑图１－２肿瘤转移过程逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋Ｔｕｍｏｒ邋ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ逡逑１５逡逑

２方法逡逑２．１邋ＳＬｅｘ－方酸乙酯的制备逡逑参照本实验室建立的方法［３９，４（）］制备。合成过程如图２－２。逡逑在ｓＬｅｘ－方酸乙酯合成过程中是用了化学合成和酶法合成结合的方法，最大逡逑限度的简化了实验步骤，减少了原材料的浪费。在ｓＬｅｘ－方酸乙酯的合成中，我逡逑们应用了邋３种一锅多酶体系，分别针对半乳糖（Ｇａｌ）、唾液酸（ＮｅＵ５Ａｃ）以及逡逑岩藻糖（Ｌ－ｆｔｉｃｏｓｅ）邋３种单糖的引入。其中用到的几种酶分别是５私ｆｏＺｗｃｆｅｒｆｗｗ逡逑／ｏｗｇｗｍ来源的ＵＤＰ糖焦a愃峄�酶（ＢＬＵＳＰ）、？ＥｓｃＡｅｒ／ｃ／ｊ／ｆｌｃｏ／／来源的尿苷二a愬义纤崞咸且旃姑福ǎ牵幔戾澹耍�、ｍｅｗ＇ｗｇｔｏｆｏ来源的卩１－４－半乳糖基转移酶逡逑（ＮｍＬｇｔＢ）、来源的邋ＣＭＰ邋唾液酸焦a愃峄�酶（ＮｍＣＳＳ）、逡逑？Ｐｏｓｔｏ／ｒｅ／／ｆｌ邋ｍｗ／ｔｏｃｚＷａ邋ｍｗ／邱ｗｃ＂＇ｏ？ａ／邋来源的邋ａ２－３－唾液酸转移酶（ＰｍＳＴｉＭ１４４Ｄ）、逡逑户ａｇ／ｔｏ来源的鸟昔二a愃嵫以逄墙筧愃峄�酶（ＦＫＰ）、７／ｅ／ｆｃｏＺ＞ｆｌＣｔｅｒ＿逡逑ｐ＿ｙ／ｏｒｆ来源的ａｌ－３－岩藻糖转移酶（Ｈｐａｌ－３ＦｕｃＴ）。逡逑以上关键酶都是利用基因重组技术进行定向改造后的酶，改造后的酶具有如逡逑下优势：均是细菌来源的酶，能够在构建的工程菌中高效表达？，催化活性高，能逡逑高收率的进行寡糖合成；底物适应性宽，能适应于各种天然及非天然的寡糖合成；逡逑对底物有严格的空间选择性、区域选择性，无需反应前对反应物进行基团保护；逡逑反应中几乎没有副产物的生�

本文编号：2776362