海带多糖酸解产物的分离分析及免疫调节作用研究

发布时间：2020-08-01 20:41

【摘要】：来源于海带的酸性多糖在结构和组成上均表现出复杂、不均一的特性。采用无机酸降解海带多糖是常用的多糖解聚方法,此外,醇沉也是传统的纯化海带多糖的方法。提取过程、分离纯化方法及降解流程的不同都会导致海带多糖的分子量、结构、组成上的差异,进而导致活性的差异。本文对海带多糖酸解后的产物进行了较为系统的研究,通过探究海带多糖酸解及沉降的条件,得到了多种结构和组成较特殊的组分,并对相应组分的活性进行了考察;从酸解产物中制备了系列硫酸化岩藻寡糖,并对主要寡糖进行了结构表征;探讨了具有强免疫调节作用的硫酸杂多糖的细胞水平的免疫调节机制。具体的有:1通过设置降解时间、沉降浓度以及选择不同沉降剂,对酸解得到的产物的化学组成及单糖组成进行了分析,通过比较,总结不同条件对产物的影响。在此基础上设置不同的流程制备了7个组分(OF1、OF2、OF3、OF4、OF5、PF1和SHP),包括水解条件下断裂的寡糖组分和较难水解的多糖组分,其中寡糖组分OF1-OF5为单糖组成以岩藻糖为主的寡糖混合物,PF1及SHP为杂多糖,分子量大于20 kD。活性筛选结果显示,寡糖组分均不能刺激小鼠腹腔巨噬细胞(RAW264.7)分泌一氧化氮,而多糖组分表现出明显的刺激作用;在马兜铃酸致大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)损伤的模型中,只有OF3和OF5在0.5 mg/mL时,以及PF1(0.5 mg/mL和1 mg/m L)表现出肾保护作用(p0.05),其余组分没有活性。2结合薄层色谱、电喷雾质谱和离子交换层析等手段,对OF1和PF1进行了化学分析及活性考察。OF1主要为硫酸化的岩藻寡糖片段,不能激活巨噬细胞,但是其离子交换层析的分级组分却具有明显的免疫诱导作用;在PF1分离组分中,发现一种葡糖岩藻半乳聚糖,其单糖组成中半乳糖:岩藻糖=2:1,具有显著的肾保护作用。3采用凝胶过滤色谱技术对OF2进行了分离,制备了系列硫酸化岩藻寡糖共6个组分,采用串联质谱方法对其中的7种单硫酸化和二硫酸化岩藻寡糖进行了结构表征,包括单硫酸化岩藻单糖、二糖、三糖、四糖(FucS、Fuc_2S、Fuc_3S、Fuc_4S),二硫酸化岩藻三糖、四糖、五糖(Fuc_3S_2、Fuc_4S_2、Fuc_5S_2)。6个组分中,只有F1、F2、F3可以抑制LPS诱导巨噬细胞的一氧化氮分泌,其他三个组分没有活性。4 SHP为具有强免疫调节作用的低硫酸化杂多糖,经降解后发现其含有的结构单元中,以葡萄糖醛酸寡糖(聚合度1-11)和甘露葡萄糖醛酸寡糖为主,还有少量的硫酸岩藻寡糖、杂合岩藻糖-甘露糖-葡萄糖醛酸寡糖。对SHP细胞水平的免疫诱导机制进行了研究,发现SHP作用于RAW 264.7巨噬细胞后,它可以被细胞表面Toll样受体-4识别,并产生相应信号,之后激活蛋白激酶B和丝裂原活化蛋白激酶,从而将信号传输到细胞核内,进而激活核因子κB和激活子蛋白与炎症相关基因结合,从而引发炎症因子的转录和表达。
【学位授予单位】：中国科学院大学(中国科学院海洋研究所)
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R915
【图文】：

沉降剂,糖醛酸含量,岩藻糖,硫酸根

图 2.1 不同降解时间对 SPF1 的岩藻糖、硫酸根和糖醛酸含量的影响，均使用乙醇作为沉降剂。A：降解结束后 50 %终浓度沉降；B：降解结束后 70 %终浓度沉降；C：降解结束后 90 %终浓度沉降。Fig. 2.1 Effect of degradation time on the fucose, sulfate and glucoronic anid content of SPF1, andthe precipitation reagent was EtOH. A: precipitation concentration was 50 %, B: precipitationconcentration was 70 %, C: precipitation concentration was 90 %.2.1.4.3 沉降浓度对 SPF1 的岩藻糖、硫酸根和糖醛酸含量的影响降解 7 小时后，用不同浓度的乙醇、乙腈或丙酮进行沉降，得到的 SPF1 进行化学分析。结果如图 2.2 显示，当用乙醇作为沉降剂时，岩藻糖、硫酸根和糖醛酸的含量均未受到沉降浓度的影响，即多糖酸解 7 小时后，用 50 %至 90 %之间的乙醇沉降时得到的 SPF1 在化学组成上差异不大。但当用乙腈或丙酮作为沉降剂时，产生的 SPF1 的岩藻糖含量在 90%时最高（33.21%、42.65%），而糖醛酸含量在 90 %时最低；而当采用 50 %丙酮进行沉降时，硫酸根含量明显降低。

岩藻糖,糖醛酸含量,沉降剂,降解时间

图 2.2 不同沉降终浓度对 SPF1 的岩藻糖、硫酸根和糖醛酸含量的影响，降解时间均为 7小时。A：沉降剂为乙醇；B：沉降剂为乙腈；C：沉降剂为丙酮。Fig. 2.2 Effect of precipitation concentration on the fucose, sulfate and glucoronic anid content ofSPF1, and the degradation time was 7 h. A: precipitation reagen was EtOH, B: precipitationreagen was can, C: precipitation reagen was acetone.2.1.4.4 沉降试剂对 SPF1 的岩藻糖、硫酸根和糖醛酸含量的影响探究沉降剂的选择对 SPF1 化学组成的影响，从前面的结果可以看出，乙醇与乙腈、丙酮存在一定的差别。图 2.3 展示了降解时间分别为 3 小时、5 小时和 7 小时时，用 90%的沉降剂进行沉降。降解 3 小时和 5 小时，岩藻糖的含量变化是一致的，采用丙酮作为沉降剂时岩藻糖含量最小，而采用乙腈作为沉降剂时岩藻糖含量最高；而当降解时间为 7 小时，采用丙酮沉降后得到的 SPF1 的岩藻糖含量最高。

糖醛酸含量,沉降,沉降剂,岩藻糖

第二章海带多糖的酸解方法研究及细胞活性筛选而沉降剂的不同对 SPF1 糖醛酸含量的影响在不同降解时间时表现不同，其中，降解 5 小时后用不同沉降剂所得的 SPF1 糖醛酸含量在 2.43 %-2.87 %之间，基本没有差异；而降解 3 小时时，乙醇和乙腈沉降所得 SPF1 的糖醛酸含量较低（1.44%、1.38%）；降解 7 小时采用 90%乙腈沉降时糖醛酸含量最低（0.91%）。由此可见，不同降解时间时，沉降剂的选择不同对 SPF1 的影响不同。

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