靶向p53抗肿瘤吲哚类生物碱小分子化合物的作用机制研究

发布时间：2020-08-02 13:54

【摘要】：肿瘤是由于某些情况下,细胞的增殖和凋亡发生异常而形成,主要受细胞中抑癌基因和原癌基因的调控,二者相互联系又相互制约,任何一环节失控都可能会导致细胞癌变。其中,P53作为一种与肿瘤相关性最高的抑制因子,大约50%的肿瘤中发生了P53基因突变。P53基因是调控保护细胞恶性转移主要通路,具有抑制或阻止细胞的增殖、转化及保护基因组稳定的作用。MDM2是目前研究较多的癌基因,MDM2蛋白能够与P53蛋白的酸性结构域和部分转录激活结构域发生结合,形成p53-MDM2复合物,而抑制P53的正常功能,进而诱导肿瘤的发生。理论上,通过阻止MDM2对P53的相互作用,可以激活肿瘤细胞中p53信号途径。因此抑制p53-MDM2之间的相互作用被认为是抗肿瘤的重要药靶之一,以此为靶点进行药物的发现和筛选。另外,据文献报道,吲哚类生物碱具有较好的抗肿瘤活性,本研究主要探究其是否对p53-MDM2靶点是否具有抑制效果,从而寻找出靶向p53抗肿瘤的新型吲哚类生物碱抑制剂。本研究设计以p53-MDM2为靶点,通过运用生物发光共振能量转移(bioluminescence resonancetransfer,BRET)技术,构建p53-MDM2相互作用的模型,将前期课题组合成的活性较好的吲哚类生物碱小分子化合物作用于该模型,进而得出吲哚类生物碱小分子化合物是否对p53-MDM2靶点具有抑制作用,最终筛选出靶向p53抗肿瘤吲哚类生物碱小分子化合物的先导化合物。本研究主要分为以下三个部分:第一部分,课题组前期已用wt P53 A549细胞对合成的40余个吲哚类生物碱小分子化合物体外抗肿瘤活性初步筛选得到了半数抑制率浓度(IC_(50))与所测阳性化合物Nutlin-3进行比较,结果显示,化合物2yy(IC_(50)=15.57μM)和3zz(IC_(50)=10.84μM)对A549细胞的抑制活性都优于阳性对照化合物Nutlin-3。因此可以初步推测化合物2yy和3zz在细胞活性和靶向p53抗肿瘤选择性上可能具有较好的效果,可继续研究其对p53-MDM2相互作用的影响。第二部分,p53-MDM2相互作用BRET模型的构建。首先将P53和MDM2基因分别克隆至含荧光蛋白基因EGFP和荧光素酶基因Rluc的载体上,分别形成融合质粒后,按照一定比例共转HEK293细胞进行融合蛋白表达,加入荧光素酶底物后,检测BRET信号,以此可以判断p53-MDM2互作效果及小分子化合物破坏其相互作用的能力。最后,用阳性化合物作对照来验证p53-MDM2互作BRET模型,最终结果表明p53-MDM2互作BRET模型是构建成功的,可用于前期吲哚类生物碱小分子化合物的作用机制研究。第三部分,具有活性的吲哚类生物碱小分子化合物对p53-MDM2相互作用的机制研究。将前期MTT法筛选出的活性较好的吲哚类生物碱小分子化合物作用于p53-MDM2互作BRET模型,研究这些小分子化合物对p53-MDM2互作机制的影响。结果表明,吲哚类生物碱小分子化合物3zz对P53与MDM2相互作用具有较好的抑制效果,可作为靶向p53抗肿瘤药物研发先导化合物进一步研究。
【学位授予单位】：贵州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R96
【图文】：

晶体结构模型,复合物

已经通过不同的方法阐明了P53与MDM2之间相互作用的位点（Kussie et al.,1996;Lane et al.,1997;Prives et al.,1999;Lohrum M Aet al., 2003）。截至目前为止主要是通过了三条途径来抑制肿瘤造成的 MDM2 蛋白的过度表达，达到释放 P53 或激活 P53 途径：（1）抑制 MDM2 作为一种 E3 泛素连接酶导致 P53 降解的功能；（2）阻止 P53 与 MDM2 的结合；（3）抑制 MDM2 基因的表达功能，从而降低细胞中 MDM2 蛋白的浓度。由于 MDM2 是P53 的主要调控因子，当前应用最普遍的方法是懫用具有 MDM2 蛋白特异性结合能力的小分子化合物，将其与 MDM2 蛋白上的 P53 结合位点结合来达到抑制二者相互结合的功能，此研究的基础是当前得到广泛接受的 P53 与 MDM2 复合物晶体结构模型。对 P53 N 端的 11个氨基酸和 MDM2 N 端 109 个氨基酸片段形成的复合物晶体的 X 衍射分析表明，MDM2的P53结合区域含有由疏水性氨基酸残基及芳香性通过两性α-螺旋和β-折叠形成的一个深层的疏水性裂隙，当 P53 上的结合位点接近 MDM2 时，被其诱导形成一个拥有 2.5 螺旋的两性α-螺旋(Chen et al., 1993)，它的疏水面直接插入 MDM2 的裂隙中(图 1-1)(刘雄伟，2018)。

含氮碱,吲哚生物碱,吲哚类,抗肿瘤作用

中重要的含氮碱性有机化合物碱在自然界中广泛存在，是迄今性，大多数吲哚生物碱具有重、抗病毒和治疗高血压等。目前时其抗肿瘤作用也在治疗癌症研究抗肿瘤活性较好的吲哚类哚类生物碱等四大类（张文会找抗肿瘤药物以及靶向小分子，吲哚并喹唑啉酮类化合物，ctoria L 的根，具有镇痛和解毒2、卵巢癌 A2780 细胞有较好端粒酶活性的表达以及能够逆

吲哚类生物碱,吲哚类化合物,哌啶,单萜

图 1-4 四氢哌啶[2, 3-b]吲哚类化合物Fig. 1-4 Hexahydro-1H-pyrido[2, 3-b]indol scaffolds第三类单萜吲哚类生物碱，如喜树碱类化合物。1966 年，Wall(Wall, M., et al.,1966)首山茱萸目珙桐科植物喜树中分离得到了吲哚类生物碱，即喜树碱(Camptothecin, CPT，-5），据报道此类生物碱具有抗肿瘤的作用。1985 年，拓扑异构酶 I (TopoisomeraseI, Topo特异性抑制剂是喜树碱被 Hsiang 等人发现，这一研究发现极大引起了人们对喜树碱的，已成为国内外抗肿瘤药物研究的热点。当前，用于临床中具有明显抗癌作用的喜树碱

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