新型线粒体靶向剂BODIPY-TPA的抗胃癌作用及其机制研究

发布时间：2020-08-06 16:31

【摘要】：目的:合成并表征新型线粒体靶向化合物BODIPY-TPA(BTPA),研究BTPA靶向线粒体以及对线粒体功能的影响,进一步研究BTPA影响线粒体氧化还原平衡与发挥抗肿瘤作用之间的关系,探讨其可能的作用机制,期望开发出集诊断治疗于一体的低毒高效的抗肿瘤化合物。方法:设计并合成新型线粒体靶向剂BTPA的纳米颗粒,使用紫外吸收、荧光光谱、核磁共振以及质谱、透射电镜等方法进行表征。使用MitoTracker Red以及Hoechst33342荧光探针共定位检测其线粒体靶向性,以不同浓度的BTPA处理MCF-7,Patu8988,MFC,AGS,BGC-823五种肿瘤细胞24h,MTT法检测细胞活度,计算抑制率并计算IC_(50)值,并比较BTPA对正常人上皮细胞HUVEC与肿瘤细胞的毒性。在体水平上,构建胃癌小鼠荷瘤模型,腹腔注射不同浓度的BTPA以及阳性对照药五氟尿嘧啶(5-Fu),小鼠处死后取肿瘤组织以及免疫器官评价内脏指数。通过HE染色以及免疫组化分析BTPA对肿瘤组织以及细胞增殖蛋白PCNA的影响,分子docking实验分析BTPA与线粒体硫氧还蛋白还原酶TrxR2的结合力,western blot检测细胞中以及肿瘤组织中TrxR2的表达,试剂盒检测总的硫氧还蛋白还原酶TrxR的活性,MDA试剂盒检测细胞的脂质过氧化水平,线粒体功能相关检测包括JC-1探针检测线粒体膜电位,试剂盒检测细胞内ATP水平,Clark氧电极用于检测细胞内耗氧量水平。试剂盒检测细胞内CAT、GSH、SOD以及Mn-SOD水平,研究BTPA对线粒体氧化还原平衡的影响。DHE以及MitoSOX探针检测细胞内和线粒体内的活性氧累积情况。Hoechst,Annexin V/PI检测细胞凋亡,并使用NAC预作用分析细胞凋亡的可能诱因。Western blot实验检测凋亡相关蛋白以及PI3K/Akt这条信号通路的变化,研究BTPA诱导细胞凋亡的具体机制。结果:紫外结果显示BTPA的最大紫外可见吸收波长为为513 nm,最大发射波长为509 nm,核磁共振氢谱显示了典型的BTPA峰,质谱图谱显示出M/Z=601.46(100)的主要分子离子峰为[(BTPA-F)+CH3CN+2H~+]~+,透射电镜显示我们获得了形态均匀形貌完整的BTPA的纳米颗粒,荧光共定位实验显示其可以选择性地定位肿瘤细胞线粒体。BTPA对人胃癌细胞BGC-823的IC_(50)数值在36.7μM左右,对正常的上皮细胞HUVEC的IC_(50)数值在113.2μM左右。在体实验发现BTPA在不影响小鼠体重正常器官(脾脏,胸腺,肝)的条件下呈现较为显著的抑制肿瘤增长的作用。肿瘤组织免疫组化以及HE染色结果也同样验证了BTPA的抗胃癌增殖作用。分子docking实验显示BTPA与线粒体TrxR2的结合力评分为-6.93,并且western blot实验显示BTPA在离体和在体水平上都下调了TrxR2的表达,但是对胞浆的TrxR1没有影响,细胞内总的TrxR的活性没有显著差异,但是细胞仍然产生了强烈的氧化应激表现为明显的MDA的提高。线粒体功能相关实验显示BTPA处理后,胃癌细胞产生了明显的线粒体功能障碍,表现为下降的线粒体膜电位以及降低的细胞ATP以及被抑制的细胞呼吸。除此之外,细胞抗氧化系统包括CAT,GSSG和GSH以及Mn-SOD都出现明显的下调,表现为线粒体抗氧化能力的下调。Western blot实验结果显示PI3K/Akt这条信号通路被下调,细胞ROS以及线粒体ROS出现明显的累积,BTPA引起了浓度依赖性的细胞凋亡,并且是线粒体介导的内源性凋亡。而NAC的预作用抑制了这种凋亡的产生。说明氧化应激是BTPA诱导细胞凋亡的直接原因。结论:BTPA具有良好的线粒体靶向性,并且具有良好的抗胃癌作用。这种抗肿瘤活性可能与线粒体氧化还原平衡的破坏有关,表现为TrxR2的下调以及线粒体抗氧化能力的下调,细胞产生强烈的氧化应激,进一步下调PI3K/Akt这条信号通路,进一步加剧细胞内活性氧的累积,形成线粒体氧化还原平衡内的恶性循环。导致线粒体功能障碍,诱导线粒体介导的内源性凋亡。
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R96
【图文】：

癌症,线粒体

9图 1.1 线粒体与癌症(引自[67])Fig. 1.1 Mitochondrial and cancer除此之外，瓦博格关于癌细胞的代谢方式还有一个重要发现，即在氧气充足的条件下机体仍将葡萄糖转化为乳酸，进行无氧糖酵解，而不是完全氧化葡萄糖以促进线粒体呼吸，也就是广为人知的“瓦博格效应”[61]。这引起了人们对线粒体在肿瘤发生发展中作用的关注。线粒体参与无氧糖酵解这一过程表明线粒体在调节氧化磷酸化与糖酵解代谢中起着积极和直接的作用。虽然“瓦博格效应”是许多（但不是所有）癌细胞无可争议的特征，但瓦博格认为它是由线粒体呼吸受损引起的，这引起了当时很大的争议。我们现在了解到，虽然受损的线粒体在某些情况下会产生瓦博格效应[72]，但许多研究结果显示拥有瓦博格代谢方式的癌细胞仍然拥有完整的线粒体呼吸，其中

癌症,肿瘤发生,新陈代谢,线粒体

的生物学功能，因为 mtDNA 中的突变影响着肿瘤发生发响肿瘤发生发展存活和转移的重要细胞器，除了产生能量方面都有助于肿瘤的进展。上述线粒体生物学的这些方面体在癌症中的多效性功能。因此，为了有效治疗癌症，了量代谢对于推进癌症治疗非常重要[84]。氧化还原稳态抗肿瘤生物学功能和癌症之间的联系历来集中在新陈代谢上，但献远远超出了新陈代谢[85]。肿瘤细胞代谢反应产生一系羟基自由基以及过氧化氢，线粒体是其主要贡献者[86]，并途径来清除 ROS，包括超氧化物歧化酶（SOD2），谷胱甘酶[87]。

跟腱,肿瘤细胞

NADPH 氧化酶的电子传递都会导致 ROS 产生，高水平的 ROS 有助于大分子（例如脂质，蛋白质和 DNA）的氧化，并且可能导致基因组不稳定性[72]。然而，在许多肿瘤中观察到适度的 ROS 升高可通过半胱氨酸氧化来调节细胞信号传导。实际上，H2O2 通过氧化半胱氨酸残基的活性位点而使肿瘤抑制因子 PTEN 失活，从而形成二硫键，进而阻止 PTEN 对 PI3K 信号通路的抑制，激活 PI3K 途径[89]。由于 ROS 可以通过半胱氨酸残基的氧化来抑制蛋白酪氨酸磷酸酶，因此 ROS 可能对通常被磷酸酶抑制的其他途径具有激活作用。肿瘤细胞为了维持内环境的稳态，应对 ROS 水平的升高，通常会上调抗氧化途径[90]。例如，致癌 K-Ras，B-raf 和 c-Myc 通过调节核因子 NRF2（一种抗氧化反应的转录调节因子）来促进肿瘤发生，抑制 ROS 的生成[91]。一项有关黑色素瘤研究发现，转移部位肿瘤细胞的 NADPH 水平高于原发肿瘤部位，这可能是肿瘤细胞为了对抗转移应激引起的 ROS 增加。类似地，抗氧化剂谷胱甘肽的治疗增加了恶性黑色素瘤小鼠模型中的肿瘤转移[92]。因此，维持 ROS 水平在一定范围内对肿瘤细胞的存活以及转移是至关重要的，在该范围内既可以刺激细胞增殖又不引起细胞毒性。

【相似文献】