肿瘤外泌体分离检测与药物递送的研究
发布时间：2020-08-07 02:09
【摘要】：外泌体是一类由所有细胞分泌,直径约为30-150nm的囊泡结构。由于其富含潜在的生物标志物,如蛋白质、mRNA及miRNA,因此而被认为具有广阔的临床应用前景。通过分析检测外泌体,可以帮助肿瘤的早期诊断、疗效评价和预后分析。另外,由于外泌体是细胞的内源性囊泡,具有免疫原性低、生物可降解性好、毒性低、能穿越血脑屏障等优点,是药物递送的良好载体。基于此,本论文的主要研究内容为:1、基于微流控电化学平台,实现对肿瘤外泌体分离富集与检测的研究。我们将易于自动化、集成化的微流控芯片与快速、高灵敏和低成本的电化学相结合,设计了一种集混合、分离富集和检测一体的外泌体分析平台(ExoPCD-chip)。ExoPCD-chip是由一个Y型微柱阵列组成的外泌体磁力捕获区域和一个设计刻饰的ITO玻璃电极组成。外泌体捕获主要是采用磁珠修饰的磷脂酰丝氨酸(PS)结合蛋白与外泌体表面暴露的磷脂酰丝氨酸特异性结合;电化学检测是利用具有CD63适配体序列和G-四链体序列的发卡结构进行信号输出。该芯片只需30 μL样品,3.5小时内完成检测,检测限低至4.39×103个外泌体/mL,检测范围横跨5个数量级。我们通过ExoPCD芯片对人血清外泌体进行了分析,并成功将肝癌患者与健康对照区分开来。2、CPPs表面修饰外泌体用于药物递送的相关研究。细胞穿透肽R9通过酰胺反应修饰到外泌体表面形成R9-EXO,G3139在静电吸附和胆固醇锚定的双重作用下与R9-EXO结合,形成R9-EXO-G3 139复合物。该复合物与肝癌细胞共孵育后,通过内吞作用进入细胞,在细胞溶酶体的作用下裂解释放G3139链。G3139通过与Bcl-2 mRNA互补,下调Bcl-2蛋白表达。R9修饰到外泌体表面,改变了外泌体进入细胞途径,由膜融合变为网格蛋白介导的内吞作用途径,更好的将外泌体表面的反义寡核酸链递送至细胞胞内,递送效率相对于未修饰时提高了 6.03倍。qRCR和Western bolt数据表明,R9-EXO-G3139可使Bcl-2 mRNA下调72.80%,Bcl-2蛋白下调了69.69%,达到了沉默肿瘤细胞Bcl-2基因表达的目的。
【学位授予单位】：华东理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R943;TQ460.1
【图文】：
用光束照射样品中的粒子，当粒子散射并进行布朗运动时，摄像机记录下每个粒逡逑子的路径，以确定平均速度和扩散率。与ＤＬＳ的体积散射测量不同，ＮＴＡ跟踪单个粒逡逑子的散射（图１．４）邋＠１。然后该信息用于数学计算浓度（即视场中的颗粒数）和尺寸分逡逑布（即通过Ｓｔｒｏｋｅｓ－Ｅｉｎｓｔｅｉｎ方程的流体动力学直径，图１．４ｂ）。然而，为了准确量化异逡逑质囊泡的浓度和大小，ＮＴＡ程序需要精确优化相机和分析设置。可能需要使用不同设置逡逑
洗脱后的外泌体具有高纯度，适用于后续的生物学分析的优点逡逑金届离子逡逑图１．３免疫亲和法分离外泌体｜６（）１逡逑Ｆｉｇ．邋１．３邋Ｅｘｏｓｏｍｅｓ邋ｉｓｏｌａｔｅｄ邋ｂｙ邋ｉｍｍｕｎｅ邋ａｆｆｉｎｉｔｙ逡逑以上这些方法均受到成本昂贵和分离方法要求的限制。此外，基于免疫亲和力的捕逡逑获只能将外泌体与无细胞样品分离。值得注意的是，在临床样本分析过程中，真实样本逡逑中的肿瘤异质性会影响免疫捕获的效率。另一个相当大的问题是使用洗脱缓冲液将外泌逡逑体从免疫复合物中释放，洗脱缓冲液的ｐＨ改变，洗涤剂和还原剂的存在可通过膜n蛲稿义闲杂跋焱饷谔骞δ堋Ｉ接谡庑┰颍庖叻掷肷胁皇视糜谕饷谔宓拇蠊婺７掷敫患郏叮保薄ｅ义希保玻餐饷谔寮觳饧际蹂义隙馍⑸洹ⅲ危裕痢ⅲ裕遥校印ⅲ牛蹋保樱痢⒘魇较赴醯确椒ㄊ羌觳夂投客饷谔遄畛Ｓ缅义系姆椒āＴ诒菊陆谥校颐墙稣庑┘际醯幕驹怼ｅ义希保玻玻倍馍⑸溴义隙馍⑸洌ǎ模蹋樱┦且恢钟糜诓饬啃苤型饷谔宥喔鑫锢硎粜缘挠行Х椒ā＃模蹋渝义喜饬坷醋酝饷谔灞坏ド庠凑丈涫辈拇罅可⑸涔狻５绷Ｗ泳祭试硕保醋运义嫌辛Ｗ拥纳⑸涔馇克媸奔涠ǘＡＷ拥亩畔⒗丛从谑笛楣讨屑锹嫉那慷裙旒５腻义献韵喙兀郏叮玻薄Ｍü樱簦颍铮耄澹螅牛椋睿螅簦澹椋罘匠蹋梢越ǘ首怀煽帕５睦┥⑾凳匀范麇义咸宥ρе本叮戳魈逯械挠行Э帕３叽纾遥瑁＃模蹋硬饬康脑汲叽绶植
本文编号：2783312
【学位授予单位】：华东理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R943;TQ460.1
【图文】：
用光束照射样品中的粒子，当粒子散射并进行布朗运动时，摄像机记录下每个粒逡逑子的路径，以确定平均速度和扩散率。与ＤＬＳ的体积散射测量不同，ＮＴＡ跟踪单个粒逡逑子的散射（图１．４）邋＠１。然后该信息用于数学计算浓度（即视场中的颗粒数）和尺寸分逡逑布（即通过Ｓｔｒｏｋｅｓ－Ｅｉｎｓｔｅｉｎ方程的流体动力学直径，图１．４ｂ）。然而，为了准确量化异逡逑质囊泡的浓度和大小，ＮＴＡ程序需要精确优化相机和分析设置。可能需要使用不同设置逡逑
洗脱后的外泌体具有高纯度，适用于后续的生物学分析的优点逡逑金届离子逡逑图１．３免疫亲和法分离外泌体｜６（）１逡逑Ｆｉｇ．邋１．３邋Ｅｘｏｓｏｍｅｓ邋ｉｓｏｌａｔｅｄ邋ｂｙ邋ｉｍｍｕｎｅ邋ａｆｆｉｎｉｔｙ逡逑以上这些方法均受到成本昂贵和分离方法要求的限制。此外，基于免疫亲和力的捕逡逑获只能将外泌体与无细胞样品分离。值得注意的是，在临床样本分析过程中，真实样本逡逑中的肿瘤异质性会影响免疫捕获的效率。另一个相当大的问题是使用洗脱缓冲液将外泌逡逑体从免疫复合物中释放，洗脱缓冲液的ｐＨ改变，洗涤剂和还原剂的存在可通过膜n蛲稿义闲杂跋焱饷谔骞δ堋Ｉ接谡庑┰颍庖叻掷肷胁皇视糜谕饷谔宓拇蠊婺７掷敫患郏叮保薄ｅ义希保玻餐饷谔寮觳饧际蹂义隙馍⑸洹ⅲ危裕痢ⅲ裕遥校印ⅲ牛蹋保樱痢⒘魇较赴醯确椒ㄊ羌觳夂投客饷谔遄畛Ｓ缅义系姆椒āＴ诒菊陆谥校颐墙稣庑┘际醯幕驹怼ｅ义希保玻玻倍馍⑸溴义隙馍⑸洌ǎ模蹋樱┦且恢钟糜诓饬啃苤型饷谔宥喔鑫锢硎粜缘挠行Х椒ā＃模蹋渝义喜饬坷醋酝饷谔灞坏ド庠凑丈涫辈拇罅可⑸涔狻５绷Ｗ泳祭试硕保醋运义嫌辛Ｗ拥纳⑸涔馇克媸奔涠ǘＡＷ拥亩畔⒗丛从谑笛楣讨屑锹嫉那慷裙旒５腻义献韵喙兀郏叮玻薄Ｍü樱簦颍铮耄澹螅牛椋睿螅簦澹椋罘匠蹋梢越ǘ首怀煽帕５睦┥⑾凳匀范麇义咸宥ρе本叮戳魈逯械挠行Э帕３叽纾遥瑁＃模蹋硬饬康脑汲叽绶植
本文编号：2783312
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