新型共轭化合物DZ-SIM对新一代抗雄药物及多西他赛耐药去势抵抗前列腺癌抗癌作用和分子机制研究

发布时间：2020-08-07 15:42

【摘要】：研究背景与目的:前列腺癌是西方国家男性最常见恶性肿瘤,预计2019全球新发病例1,276,106例,死亡病例358,989例。初诊前列腺癌病人中,仅约6%有转移病灶,但死于前列腺癌病人中90%有骨转移灶。近年来,随着我国人口老龄化和生活方式的改变,前列腺癌的发病率明显上升,与西方国家不同,我国前列腺癌患者中晚期比例更高,因此预后更差。前列腺癌是由雄激素信号通路推动,抗雄治疗能抑制血清睾酮水平,在抗雄治疗开始早期,前列腺癌能控制良好。但抗雄治疗并非治愈性治疗,几乎所有病人会出现疾病进展。抗雄治疗过程中,睾酮处于去势水平,此时前列腺癌进展被称为去势抵抗性前列腺癌。在很长的一段时间,转移性去势抵抗性前列腺癌的一线治疗方案均为多西他赛。近年来,随着新一代抗雄药物如阿比特龙和恩杂鲁胺等的出现,多西他赛耐药病人均采用新一代抗雄药物治疗并能有效延长病人生存期。最近,新一代抗雄药物也被用于化疗前转移性去势抵抗性前列腺癌病人的治疗并取得良好效果。临床研究发现,新一代抗雄药物阿比特龙治疗后产生耐药的病人也会对多西他赛产生耐药。尽管多西他赛和新一代抗雄药物能有效改善去势抵抗性前列腺癌患者的无进展及总体生存期,但整体而言对患者的预后改善仍十分有限,经过一段时间的治疗后,最终会进展为对两类药物均耐药的去势抵抗性前列腺癌。课题组前期合成一组HMCD染料,该类染料具有能使肿瘤显像并富集于肿瘤的特性,后来,将该HMCD分子命名为DZ-1并以DZ-1为基础合成一系列共轭化合物如DZ-gemcitabine、DZ-Cisplatin和DZ-SIM药物等,DZ-SIM抑制前列腺癌细胞生长作用最强。DZ-SIM是以辛伐他汀(Simvastatin,SIM)与七甲川菁(heptamethine carbocyanine)近红外(near infrared,NIR)荧光染料为基础合成的共轭化合物。本课题拟研究共轭化合物DZ-SIM的肿瘤靶向性并明确该化合物对肿瘤生长的抑制作用及其作用机制。第一部分共轭化合物DZ-SIM对耐二代抗雄药物和化疗药物的去势抵抗性前列腺癌细胞恶性生物学行为的抑制作用内容与方法:(1)结晶紫法细胞增殖实验检测不同浓度DZ-SIM对各种前列腺癌细胞增殖的抑制作用;(2)克隆形成实验检测不同浓度DZ-SIM对去势抵抗性前列腺癌细胞C4-2B以及恩杂鲁胺耐药去势抵抗性前列腺癌细胞C4-2B MDVR、多西他赛耐药去势抵抗性前列腺癌细胞C4-2B TaxR存活能力的影响;(3)划痕实验和transwell小室穿梭实验(有和无matrigel覆盖小室膜)检测不同浓度DZ-SIM对耐药去势抵抗性前列腺癌细胞迁移和侵袭能力的影响;(4)皮下移植瘤模型:选取NOD-SCID小鼠,于小鼠双侧皮下注射CWR22RV1细胞,游标卡尺定期监测小鼠皮下移植瘤生长情况,评估DZ-SIM对去势抵抗性前列腺癌细胞肿瘤生长能力的影响。结果:(1)结晶紫细胞增殖实验发现DZ-SIM对各类前列腺癌细胞增殖均有很强的抑制作用,DZ-SIM对耐药去势抵抗性前列腺癌细胞的抑制作用呈时间和浓度依赖性,而DZ-1和SIM对癌细胞抑制作用较弱;(2)克隆形成实验提示DZ-SIM对耐药去势抵抗性前列腺癌细胞的生长有明显的抑制作用,且DZ-SIM浓度越高,对癌细胞的抑制作用越明显;(3)划痕实验和transwell小室穿梭实验发现DZ-SIM明显抑制耐药去势抵抗性前列腺癌细胞的迁移和侵袭,且DZ-SIM浓度越高,对癌细胞迁移和侵袭能力抑制越明显;(4)皮下移植瘤模型可见DZ-SIM明显抑制去势抵抗性前列腺癌细胞的生长;。结论:DZ-SIM在体内和体外均能显著抑制耐新一代抗雄药物和化疗药的去势抵抗性前列腺癌的增殖,DZ-SIM有望作为新的靶向药物在临床用于对新一代抗雄药物和化疗药耐药的去势抵抗性前列腺癌病人的治疗。第二部分共轭化合物DZ-SIM对耐新一代抗雄药物和化疗药物的去势抵抗性前列腺癌细胞抗癌作用的机制研究内容与方法:(1)Mitotracker检测药物亚细胞定位与线粒体关系;(2)流式细胞仪检测线粒体膜电位;(3)Seahorse XFe 96分析仪计算C4-2B细胞、C4-2B MDVR细胞和C4-2B TaxR细胞最佳FCCP浓度后使用Seahorse XFe 24分析仪使用细胞线粒体压力测试试剂盒明确DZ-SIM对耐新一代抗雄药物和化疗药物的去势抵抗性前列腺癌的基础耗氧率(Oxygen consumption rate,OCR)的影响;(4)转录组测序和生物信息学分析寻找DZ-SIM抑制耐药去势抵抗性前列腺癌细胞的共同作用靶点并用qRT-PCR验证测序结果。结果:(1)Mitotracker检测拍照与DZ-SIM图像融合提示在C4-2B MDVR和C4-2B TaxR细胞中,DZ-SIM均定位于线粒体起作用;(2)DZ-SIM降低C4-2B MDVR和C4-2B TaxR细胞线粒体膜电位;(3)C4-2B细胞、C4-2B MDVR细胞和C4-2B TaxR细胞最佳FCCP浓度分别为0.5μM、0.25μM和1μM。与C4-2B细胞相比,耐药细胞C4-2B MDVR和C4-2B TaxR的OCR和ECAR均明显升高,DZ-SIM处理后能明显降低C4-2B MDVR和C4-2B TaxR细胞OCR;(4)转录组测序后行生物信息学分析发现在耐药去势抵抗性前列腺癌细胞中有72个共同表达升高的基因,DZ-SIM处后共同降低的有四个基因(CAMK2N1、HMGCS2、NR2F1和CDH3),qRT-PCR进一步验证发现,耐药细胞中四个基因表达量升高,DZ-SIM处理后表达量明显降低。结论:DZ-SIM定位于线粒体并降低耐药去势抵抗性前列腺癌细胞线粒体膜电位,DZSIM主要通过影响癌细胞线粒体代谢起作用,CAMK2N1、HMGCS2、NR2F1和CDH3是DZ-SIM在耐药去势抵抗性前列腺癌细胞中的潜在作用靶点。
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R96
【图文】：

甲川,荧光染料,近红外,分子式

经过不断改进合成方式，增加了 DZ-1 的稳定性和水溶性[1, 14, 15]，结构式如图1-1-A，辛伐他汀结构式如图 1-1-B，LelandW.K.Chung 教授实验室（本实验室）通过酰胺键将二者耦合而成，结构式如图 1-1-C，共轭化合物 DZ-SIM 分子量为 1180.04，最终将该共轭化合物命名为 DZ-SIM。图 1-1-A 七甲川菁（heptamethine carbocyanine）近红外（near infrared，NIR）荧光染料 DZ-1 的分子式

辛伐他汀,分子式,共轭化合物

图 1-1-B 辛伐他汀（Simvastatin）的分子式 1-1-C 新型共轭化合物 DZ-SIM 的分子式，分子量=11DZ-SIM 体外实验中能快速有效杀伤前列腺1 和 Simvastatin 对前列腺癌细胞影响较小。1 是常用的去势抵抗性前列腺癌细胞，我们选其进行 DZ-SIM 对 CWR22RV1 细胞增殖的抑制作用，统计分

共轭化合物,分子式,分子量

图 1-1-C 新型共轭化合物 DZ-SIM 的分子式，分子量=1180.04。（二）DZ-SIM 体外实验中能快速有效杀伤前列腺癌细胞，其原型药 DZ-1 和 Simvastatin 对前列腺癌细胞影响较小。CWR22RV1 是常用的去势抵抗性前列腺癌细胞，我们选其进行初步研究，采用结晶紫法检测 DZ-SIM 对 CWR22RV1 细胞增殖的抑制作用，统计分析并计算半抑制浓度（halfmaximalinhibitoryconcentration,IC50）。浓度最高孔为 50μM，各孔倍比稀释，梯度设置为 0,0.39, 0.78,1.56,3.125,6.25,12.5,25,50μM，如图 1-2 所示。药物作用 24 小时后，结晶紫法检测细胞增殖。统计分析示 DZ-1 和 Simvastatin 在 CWR22RV细胞中的 IC50>50μM，而 DZ-SIM 对前列腺癌 CWR22RV1 的 IC50 为 4.2μM（图 12），由此可知，对去势抵抗性前列腺癌细胞起杀伤作用的主要是新型共轭化合物 DZSIM。

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