肝富集转录因子和异源物核受体的优化组合及对肝细胞功能的影响

发布时间：2020-08-08 07:37

【摘要】：目的:本研究通过构建含肝细胞尿素代谢关键酶和几种主要CYP基因核心启动子和增强子区域共有的肝富集转录因子(LETF)或异源物核受体的慢病毒表达载体,筛选对肝细胞氨代谢(尿素循环通路)和药物代谢均有重要影响的最优LETF+异源物核受体组合,构建能够同时应用于BAL和肝毒性药物检测的功能突出的肝细胞。方法:1、采用腺病毒策略,利用其瞬时表达的特性对几种常见的LETFs(C/EBPβ、HNF3β、HNF4α、HNF1α、HNF6和PGC1α)进行多重组合筛选,通过实时定量PCR检测五种主要的尿素循环关键酶(Arg1、OTC、CPS1、ASS和ASL)mRNA表达水平,从而筛选出对五种尿素循环关键酶正向调控较优的肝富集转录因子组合。2、在之前组合的基础上,加入涉及对CYP酶合成进行调控的异源物核受体(CAR和PXR),再次进行多重组合筛选,通过实时定量PCR检测五种尿素循环关键酶和五种细胞色素氧化酶P450(CYP1A1、CYP2B6、CYP29、CYP2D6和CYP3A4)mRNA的表达水平,同时采用WB对它们的蛋白合成水平,最终确定对尿素循环和药物代谢均有显著影响的LETFs+异源物核受体的最优组合。3、利用慢病毒稳定表达的特性,构建过表达优化组合LETFs和异源物核受体的肝细胞株。4、检测肝源性尿素生成量,验证优化重组肝细胞株的尿素代谢功能,同时采用CYP酶试剂盒间接检测重组肝细胞株的CYP功能,最终确定LETFs和异源物核受体的优化组合对肝细胞功能的影响情况。结果:1、结合前期实验小组对ARG1、CPS1、OTC三种关键酶启动子的研究,结合现有文献资料,获得与转录调控密切相关的肝富集转录因子C/EBPβ、HNF3β、HNF4α、HNF1α、HNF6和PGC1α和异源物核受体PXR和CAR,并将其分别构建于腺病毒表达载体。2、将34种腺病毒组合分别瞬时转染于HepG2细胞中,实时荧光定量检测五种尿素关键酶mRNA的表达(结果以2~(-△△Ct)值表示)。结果显示,在不同转录因子组合的共同作用下,五种尿素酶的表达情况都各有不同。综合多方面考虑,初步筛选排除掉一些明显不合适的组合后,再对剩余的组合各自的五种酶实际qPCR表达值进行分析,综合优选出了三种合适的组合用于下一步的实验,分别为“C/EBPβ+HNF3β+HNF4α”、“C/EBPβ+HNF3β+HNF1α”、“C/EBPβ+HNF4α+HNF6”。3、为充分考虑到CYP酶的表达情况,将上述三个转录因子腺病毒组合分别与核受体PXR和CAR进行11种组合,分别再次转染HepG2细胞,实时定量检测五种尿素代谢酶和五种CYP酶(CYP1A1、CYP2B6、CYP2C9、CYP2D6和CYP3A4)的mRNA表达情况。结果显示,在不同转录因子组合的共同作用下,十种功能酶的表达情况都各有不同。为使结果获得更直观的效果,将所有2~(-△△Ct)结果以“1”、“1 2”、“2”分段并使用不同颜色进行标识,其颜色深浅与mRNA表达水平的高低成正比关系,综合分析优选出“C/EBPβ+HNF4α+HNF6+PXR”与“C/EBPβ+HNF4α+HNF6+CAR”两种组合,并构建稳定过表达两种优化组合的HepG2细胞和BEL-7404细胞。4、WB结果显示,两种不同组合的重组细胞都高表达ASL蛋白,而ASS蛋白却呈低水平状态。并且,在C/EBPβ+HNF4α+HNF6+PXR组合的作用下Arg1、OTC和CPS1三种蛋白都呈现高表达状态。5、检测了两种重组细胞的尿素合成量,评估重组细胞对氨的代谢能力。随着氨浓度的增加,两种不同组合重组细胞的尿素生成量有不同程度的增加。并且,在氨浓度较低的情况下,C/EBPβ+HNF4α+HNF6+PXR组合在提高肝细胞的尿素产量效果上明显高于对照组和C/EBPβ+HNF4α+HNF6+CAR组合。在高浓度氨的条件下,C/EBPβ+HNF4α+HNF6+CAR重组肝细胞的尿素产量有一定程度的提高。然而,两种不同组合肝细胞的在尿素代谢功能在一定程度上还远不及原代肝细胞。6、同时检测两种重组细胞五种不同CYP酶蛋白合成水平和功能。在两种不同转录因子组合的作用下,CYP1A1、CYP2D6和CYP3A4蛋白表达水平明显增高,而CYP2B6蛋白水平呈现低表达状态,CYP2C9表达水平则未见明显改变,这一效果在功能检测得到进一步验证。结论:1、针对尿素循环和药物代谢两大功能进行分析,在肝富集转录因子和异源物核受体的组合中,以C/EBPβ+HNF4α+HNF6+PXR组合和C/EBPβ+HNF4α+HNF6+CAR组合较为理想,在一定程度上,两种组合都能明显改善氨代谢和药物代谢两大功能。2、针对尿素代谢功能进行分析,C/EBPβ+HNF4α+HNF6+PXR组合优于C/EBPβ+HNF4α+HNF6+CAR组合。3、针对药物代谢功能进行分析,C/EBPβ+HNF4α+HNF6+PXR组合和C/EBPβ+HNF4α+HNF6+CAR组合彼此间未见明显差异。4、综合分析,在同时改善氨代谢和药物代谢两大功能方面C/EBPβ+HNF4α+HNF6+PXR组合效果更优,有望为进一步的多种实验性应用提供取用便捷的人源肝细胞。
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R96
【图文】：

细胞活性,重组细胞,活性水

CYP2C9、CYP2D6 和 CYP3A4）在重组 HepG2 细胞（R1/R2）和重组 BEL-7404（R1/R2）中的蛋白表达水平情况。NC 组设置为标准对照 1。（C）：5 种 CYP 活力水平情况。采用Lytic P450-Glo 试剂盒，化学发光仪检测 CYP 活性水平，数值与 CYP 活性成正比，越高，代表活力水平越高。 (*P<0.05 ， n=3) 。 ( 注释： R1 和 R2 分别代表C/EBPβ+HNF4α+HNF6+CAR 组和 C/EBPβ+HNF4α+HNF6+PXR 组)。5 重组细胞活性水平检测为检测过表达优化组合对细胞活性的影响，我们比较了两种重组细胞在第1 天、第 3 天、第 5 天和第 7 天的细胞活力（图 5）。结果显示，两种不同组合重组细胞活力在前 3 天呈上升状态，而第 5 天之后呈现明显下降的趋势。相较于对照组细胞，虽然 C/EBPβ+HNF4α+HNF6+CAR 重组细胞活力稍微降低，但是经分析并无统计学意义。

【参考文献】