基于细胞膜色谱技术和亲和探针技术的药物靶标分析

发布时间：2020-08-08 22:52

【摘要】：尽管组合化学、超高通量筛选、后基因组计划、计算机技术的联合应用等多种技术快速发展,在药物研发的过程中仍然存在两个瓶颈,一是靶标生物大分子的确定和验证;二是具有生物活性小分子的设计和发现。本文主要关注第一方面,即其中的靶标分析方面。1.整合细胞膜色谱系统的构建及在VEGFR-2受体抑制剂靶标鉴定上的应用细胞膜色谱技术(cell membrane chromatography,CMC)是一种生物膜技术和色谱技术结合的分析方法,在一定程度上保留了细胞膜的生物学特征,可以模拟生理状态下生物活性小分子与其细胞膜上靶蛋白相互结合的过程。整合细胞膜色谱系统由多种细胞膜色谱模型、高效液相色谱、飞行时间质谱整合而成,其中,多种细胞膜色谱模型既相互补充,又相互验证,弥补了生物膜生命周期短、重现性差的内在缺点;高效液相色谱可以对复杂样品进行有效分离;飞行时间质谱可以准确鉴定其中每种组分,使得到的结论与常规的细胞膜色谱相比,更加真实、准确、可信。本部分应用SMMC-7721/CMC和HepG2/CMC两种不同原发性肝癌的细胞膜色谱模型,构建了整合细胞膜色谱分析系统,并用于8个人工合成化合物的活性和靶点评价研究中,这8个喹唑啉类化合物是针对血管内皮生长因子受体-2(vascular endothelial growth factor receptor-2,VEGFR-2)进行设计合成的。在使用整合细胞膜色谱系统进行靶标验证的同时,也采用经典的激酶抑制方法测定了以上8个化合物对VEGFR-2的抑制率。结果表明,化合物在整合细胞膜色谱系统中的保留行为与激酶抑制率高低排序一致,即上述两种方法存在相关性。与分别测定每个待评价化合物样品的传统方法相比,整合细胞膜色谱系统可以直接分析含有多种样品的复杂体系,得到结论真实、可靠,同时,更加节约时间和成本,可成为药物研究中的一种实用分析方法。2.TCP-matrine探针的合成及在matrine靶标分析中的应用整合细胞膜色谱系统可以快速、有效地分析生物活性小分子与细胞膜蛋白质间是否存在相互作用,然而自然生物膜上含有成百上千种活性蛋白,小分子药物可能与多种受体存在协同结合,受到各种非特异结合因素的干扰,在没有其他关于可能结合靶标相关信息的线索下,很难鉴定、确证或排除某种膜蛋白作为潜在靶标的可能性,因此,将整合细胞膜色谱系统用于生物活性小分子结合靶标的准确鉴定和验证中,尚有困难,仍然需要其他更加深入、精细、直接的靶点鉴定技术的支持和配合,如基于亲和探针的靶点分析技术。三功能探针(tri-functional probe,TCP)是亲和探针的一种,是一种同时具有配体基团、光反应基团、标签基团三种功能基团的探针,是生物活性小分子靶标鉴定的有效手段。苦参碱(matrine)是一种天然生物碱,被发现具有抗肿瘤的活性,但其直接结合靶标和相关分子作用机制尚不明确,这也是阻碍将苦参碱进一步进行结构改造、活性增强、药物剂型改良等研究开发,最终成为临床一线治疗药物的众多障碍之一。因此,寻找并鉴定到苦参碱的直接作用靶标,意义重大。TC P-matrine探针是一个同时具有matrine、4-苯甲酸叠氮基、生物素的亲和探针,其中matrine作为配体基团,4-苯甲酸叠氮基作为光反应基团,生物素作为标签基团,与链霉亲和素构成生物放大系统,用于靶蛋白的纯化分析。本部分将TCPmatrine亲和探针用于matrine的靶点鉴定研究中,首次证明了膜联蛋白A2(annexin A2,ANXA2)是中药苦参中的活性成分苦参碱(同时也是一个有前景的抗癌药)的直接结合靶蛋白,通过抗体阻断实验和敲低表达实验进一步证实了ANXA2是苦参碱发挥抗迁移药效的关键分子,苦参碱可以有效抑制ANXA2介导的纤溶酶原(plasminogen,PLG)向纤溶酶(plasmin,PN)的生物转化,从而抑制肿瘤细胞的迁移。3.TCP-MLN8237探针的合成及在MLN8237靶标分析中的应用MLN8237是极光激酶A(Aurora Kinase A,AKA)的小分子选择性抑制剂,具有抑制细胞生长、发育,诱导细胞凋亡,抑制细胞迁移、侵袭等多种活性,Ⅰ期临床试验也表明MLN8237在恶性肿瘤方面具有较好的治疗作用,同时存在一定程度的不良反应,如恶心、呕吐、发热、贫血等,在理论上,MLN8237可能存在其他潜在靶蛋白。寻找并鉴定到小分子MLN8237的其他直接作用靶点,为阐明其作用机制,更全面地掌握该分子特性,最终实现其广泛的临床应用,具有重要的意义。在明确MLN8237构效关系的基础上,对其羧基部分进行结构修饰,首次合成了TCP-MLN8237探针,该探针含有MLN8237、4-苯甲酸叠氮基、生物素三种不同的功能基团,且探针与药物分子本身在促进细胞凋亡上没有明显差异。与对照探针(骨架相同但不含有配体基团MLN8237,只含有4-苯甲酸叠氮基、生物素基团的探针)处理组相比,经紫外光照射、磁珠纯化富集、凝胶电泳分离、银离子染色等操作后,只分离得到一个差异蛋白条带,经多级蛋白质谱技术分析鉴定,该蛋白为AKA,即目前公认的MLN8237的最强靶点,说明TCP-MLN8237探针是有效的,但由于探针为刚性结构,可能对配体基团与其靶蛋白间相互结合过程有影响,仍然存在一些的局限,具有优化和改进的空间。4.DNA-MLN8237探针的合成及在MLN8237靶标分析中的应用在TCP亲和探针的基础上,将赖氨酸的刚性骨架更新为寡核苷酸链的柔性骨架,称为DNA亲和探针,由结合探针(binding probe,BP)与捕获探针(capture probe,CP)共同组成。本部分利用DNA亲和探针标记方法,合成了含有MLN8237的BP,含有4-苯甲酸叠氮基、荧光素的CP,经过BP(MLN8237)与靶蛋白结合、CP(4-苯甲酸叠氮基)与靶蛋白光交联、CP(荧光素)在聚丙烯酰胺电泳胶上成像的步骤,最终鉴定得到除AKA之外的7个潜在靶蛋白,在这些潜在靶蛋白分子中,对p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinase,p38)和层粘连蛋白受体(laminin receptor,LAMR)进行了生物学验证,其中,MLN8237与p38亲和力约为8μM,相关生物学功能效应(促进细胞凋亡)可能被AKA所掩盖;MLN8237与LAMR亲和力约为1.8μM,可以部分解释其抗肿瘤迁移和侵袭的生物学功能,为更深入地理解MLN8237的药效、毒性、副反应提供有效信息,为全面评价MLN8237作为潜在临床候选药物提供进一步证据。同时,也说明,利用DNA亲和探针寻找小分子的靶点,是一种十分有效的分析方法。
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R917
【图文】：

流程图,流程图,加利福尼亚州,流速

整合细胞膜色谱分析平台是基于Aglient 1200系列高效液相色谱系统，由AgilentMassHunter 工作站控制（Aglient科技有限公司，帕洛阿尔托，加利福尼亚州，美国）。流路系统见下图2-1。SMMC-7721和HepG2细胞膜色谱柱分别位于一个MXP9960的二位十通阀（罗内特帕克，加利福尼亚州，美国）。另一装有两个500μL的样品环同时作为柱切换装置和两维色谱的切换界面。 SMMC-7721/CMC 和 HepG2/CMC（10mm×2.0mm id，5μm）作为第一维，Chromolith Performance RP-18e硅胶整体柱（100mm×4.6mm id 5μm，默克，达姆施塔特，德国）作为第二维。第一维色谱的流动相为5mM醋酸铵，流速为0.2mL/min。第二维色谱的流动相为0.1%甲酸水（A相）和乙腈（B相）。系统洗脱的流速为3.5mL/min，分流进样后进入TOF-MS系统的流速约为0.4mL/min。每隔2.5min，第一维色谱分析得到的色谱馏分存贮于定量环中，进入第二维色谱分离。质谱条件如下：正离子模式全扫描

喹唑啉酮,衍生物,乙腈

90%-20%乙腈。2.2.10 整合 CMC-HPLC-TOF-MS 系统的应用八个喹唑啉酮衍生物以VEGFR-2为靶标设计合成，化学结构见图2-2。这些化合物的活性考察是将八个化合物的混合样品进样至整合CMC-HPLC-TOF-MS系统进行分离、分析和鉴定。混合样品溶液第一维色谱的流动相为5 mM醋酸铵，第二维分析的洗脱条件为：0-2.0 min，30%-45% 乙腈；2.0-4.5 min，45%-90%乙腈；4.5-5.0min，90%-30%乙腈。图2-2：喹唑啉酮衍生物的结构Figure 2-2: Structures of the synthetic quinazoline derivatives.

谱图,工作系统,抑制剂,进样

- 24 -标分别位于细胞质和细胞核）作为阴性对照。将包含上述四种对照的样品混合液进样至系统中进行分析，其二维色谱图见图2-3，结果显示，索拉菲尼和维拉帕米在SMMC-7721/CMC和HepG2/CMC色谱柱上有显著保留，而地塞米松和四环素则基本没有保留。上述结果表明SMMC-7721和HepG2/CMC/整体柱/TOF-MS系统可以识别结合膜受体的活性组分，因而可以用于VEGFR-2潜在抑制剂的活性评估。2.3.3 应用整合 CMC-HPLC-TOF-MS 系统对潜在 VEGFR-2 抑制剂的活性评价针对VEGFR-2设计合成了八个喹唑啉类衍生物，将包含八种样品的混合溶液进样至系统进行分析，根据八种化合物在第一维CMC中保留时间的不同进行活性高低的排序，根据不同的分子量在第二维TOF-MS中进行准确鉴定（见表2-1）。混合样品的二维色谱图见图2-3。从保留情况看，化合物S4和S8在SMMC-7721/CMC和HepG2/CMC上均有保留

【相似文献】