微囊藻毒素对人肝细胞系HL7702及小鼠肝组织胰岛素信号通路相关蛋白影响研究

发布时间：2020-08-08 23:28

【摘要】：研究目的:微囊藻毒素是一种危害极大的单环七肽类化合物,是蓝藻的某些属类产生的次生代谢产物,在发生水华的水体中普遍存在。当前日渐严重的水体富营养化导致水华频发以致大量微囊藻毒素产生并被释放进入水体。微囊藻毒素严重影响人类健康。目前很多研究表明,微囊藻毒素与人原发性肝癌、大肠癌的发生都有紧密的相关性。近期又有研究发现Microcystin-LR(MC-LR)可能是引起糖尿病的环境致病因素之一。在本实验室的前期研究中,我们发现不同浓度的MCLR染毒24 h能够引起人肝细胞株HL7702及小鼠肝脏组织中胰岛素信号通路关键蛋白磷酸化水平的改变。由于胰岛素信号通路具有应对胰岛素刺激作出快速反应的能力并有十分复杂的反馈机制,探讨胰岛素信号通路信号蛋白对微囊藻毒素作用的响应时间效应显得尤为重要。因此本研究的目的是研究在更短的染毒时间条件下不同浓度MCLR对肝脏胰岛素信号通路相关蛋白的影响以及作用的特点,该研究有助于我们今后对微囊藻毒素与代谢疾病的关系更加完整的认识。研究内容:(一)细胞实验:以人肝细胞株HL7702为材料,探讨不同浓度MCLR在不同染毒时间(30min、1h、6 h)下对蛋白磷酸酶2A(PP2A)活性以及胰岛素信号通路关键信号分子,包括Akt、GSK3α、GSK3β及其下游底物糖原合酶(GS)的影响;(二)动物实验。以ICR雄性小鼠为材料,研究在腹腔注射不同浓度MCLR 1小时后MCLR在肝、胰组织中的积累,MCLR对肝、胰腺的病理学影响,以及对肝脏PP2A及肝脏胰岛素信号通路关键分子,包括IRS1、Akt、GSK3α、GSK3β及底物GS的影响,并对其中一些指标同时采取western blot和免疫组化方法检测以互相验证。通过细胞实验与动物实验结果的比较分析来探讨短时间染毒条件下MCLR对肝脏胰岛素信号通路的影响及通过结合前期的24 h实验结果来进一步分析可能的作用模式。研究方法:应用免疫印迹技术、细胞酶活力检测研究不同浓度MCLR(0μM、1 μM、5 μM、10 μM)对人肝细胞系HL7702中胰岛素信号通路关键信号分子的影响,应用免疫印迹技术、细胞酶活力检测、免疫组化、HE组织染色技术研究不同浓度MCLR(0 μg/kg、40 μg/kg、80 μg/kg、120 μg/kg)对小鼠肝脏组织中胰岛素信号通路关键信号分子的影响。研究结果:(一)MCLR处理HL7702细胞30 min、1h、6h后均造成PP2A活性的抑制,抑制率呈现染毒浓度及染毒时间依赖性。(二)在HL7702细胞中,MCLR处理细胞30min、1h、6h均引起Akt的磷酸化上升,影响了GSK3和GS的磷酸化水平。(三)给ICR雄性小鼠腹腔注射不同浓度的MCLR后发现,染毒1 h的小鼠活动无明显异常,染毒2h,高剂量组(120 μg/kg MCLR)小鼠开始出现死亡,染毒5h后最高及次高剂量组(80、120 μg/kg MCLR)的小鼠全部死亡。(四)对小鼠肝脏进行HE染色观察发现,高剂量组的小鼠肝脏相比对照组有明显的肝细胞变性(浊肿)以及肝出血,但没有发现MCLR对于胰腺有明显作用。(五)给ICR雄性小鼠腹腔注射MCLR 1 h后测定其肝脏PP2A活性,发现PP2A的酶活性呈现浓度依赖性下降,Akt的Ser473以及Thr308位点的磷酸化水平均呈现浓度依赖性升高,GSK3α以及GSK3β的磷酸化水平和GS及其磷酸化在MCLR刺激下有升高趋势,其中AKT的Ser473位点的磷酸化、GSK3β的磷酸化以及GS蛋白水平升高的结果在免疫组化中得到良好验证。(六)腹腔注射ICR雄性小鼠1h取其肝脏,肝组织内IRS1的Ser磷酸化水平显著升高,IRS1总蛋白水平下降。研究结论:(一)在短时间染毒条件下,MCLR抑制人肝细胞系HL7702中PP2A活性,且酶活性抑制率与染毒时间和染毒浓度呈正相关关系。(二)在短时间染毒条件下小鼠肝细胞中Akt磷酸化水平受MCLR作用后变化明显,表明其极短时间里就会受到MCLR的影响,这也为检测MCLR对肝脏胰岛素通路的早期影响提供了一个敏感指标。(三)短时间染毒,MCLR将通过影响IRS1、Akt、GSK3α、GSK3β、GS的磷酸化水平而对肝细胞胰岛素信号通路产生干扰。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R99
【图文】：

细胞内,信号通路,胰岛素,抑制率

基于本实验室的前期研究结果，本研究选取１邋ｐＭ、５ｐＭ、１０ｐＭ的ＭＣＬＲ胞染毒浓度，在此浓度下ＭＣＬＲ对细胞活力以及细胞周期没有产生明显影响１４６期研究发现２４邋ｈ染毒ＭＣＬＲ对胰岛素信号通路的信号蛋白有影响＃１，本研究染毒时间３０ｍｉｎ、１邋ｈ和６ｈ，检测ＭＣＬＲ对ＰＰ２Ａ活性、胰岛素信号通路中要信号蛋白Ａｋｔ、ＧＳＫ３、及底物ＧＳ总蛋白及磷酸化蛋白的影响。逡逑．１逦ＭＣＬＲ对ＨＬ７７０２细胞中ＰＰ２Ａ活性影响逡逑如图４．１．１所示，染毒３０邋ｍｉｎ后ＭＣＬＲ就对细胞内ＰＰ２Ａ活性有了明显的作用。在三种染毒时间中，ＭＣＬＲ均能够引起ＰＰ２Ａ酶活力的下降，随着染毒的延长，ＭＣＬＲ对ＰＰ２Ａ的抑制率也增加。染毒６邋ｈ时，ＭＣＬＲ对ＰＰ２Ａ活性制率与本实验室之前研究中２４邋ｈ染毒的抑制率相似，半抑制浓度ＩＣ５０约在５逡逑ｌＯｐＭ之间丨４７１。逡逑－

细胞内,灰度分析,印迹法,免疫印迹法

４．１．２ＭＣＬＲ对ＨＬ７７０２细胞内Ａｋｔ总蛋白水平及其磷酸化的影响。用ＭＣＬＲＨＬ７７０２细胞如图所示浓度和时间后，用免疫印迹法检测Ａｋｔ、ｐ－Ａｋｔ邋（Ｔｈｒ３０８及ｐ－Ａｋｔ邋（Ｓｅｒ４７３）水平，对免疫印迹法检测结果进行灰度分析后用独立样本ｔ验进行数据分析，＊，邋ｐ＜０．０５；邋＊＊，ｐ＜０．０１，邋＊＊＊，ｐ＜０．００１；邋ｎ＝３。逡逑ｉｇ．邋４．１．２邋Ｔｈｅ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ＭＣＬＲ邋ｏｎ邋Ａｋｔ，邋ｐ－Ａｋｔ邋（Ｔｈｒ３０８）邋ａｎｄ邋ｐ－Ａｋｔ邋（Ｓｅｒ４７３）邋ｉｎ邋ＨＬ７７０２Ｌ７７０２邋ｗｅｒｅ邋ｅｘｐｏｓｅｄ邋ｉｎ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ邋ｏｆ邋ＭＣＬＲ邋ｆｏｒ邋３０邋ｍｉｎ，邋１邋ｈ邋ａｎｄ邋６邋ｈｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ邋ｂｅｆｏｒｅ邋Ａｋｔ，邋ｐ－Ａｋｔ邋（Ｔｈｒ３０８）邋ａｎｄ邋ｐ－Ａｋｔ邋（Ｓｅｒ４７３）邋ｗｅｒｅ邋ｅｘａｍｉｎｅｄ邋ｂｙ邋ｗｅｓｔｅｒｎｌｏｔ．邋Ｔｈｅ邋ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｙ邋ｗａｓ邋ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ邋ｔｏ邋ｏｂｔａｉｎ邋ｈｉｓｔｏｇｒａｍ邋ａｎｄ邋ｔｈｅ邋ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅｓ邋ｗｅｒｅｎａｌｙｚｅｄ邋ｂｙ邋ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ邋ｓａｍｐｌｅ邋ｔ－ｔｅｓｔ，邋＊，邋ｐ＜０．０５；邋＊＊，邋ｐ＜０．０１；邋ｎ＝３．逡逑．１．３邋ＭＣＬＲ对ＨＬ７７０２细胞中ＧＳＫ３的影响逡逑ＧＳＫ３是Ａｋｔ的底物之一，Ａｋｔ磷酸化ＧＳＫ３而抑制其激酶活性ｌ４９］。我们前ＭＣＬＲ染毒２４ｈ实验中ｐ－ＧＳＫ３ａ、Ｐ－ＧＳＫ３Ｐ都是明显升高的。本研究中，免迹结果（图４．１．３）显示，不同浓度ＭＣＬＲ处理ＨＬ７７０２邋不同时间后，细胞内ＧＳＫ３以及0３艮３０总蛋白含量无明显

细胞内,灰度分析,活性状态,印迹法

图４．１．３邋ＭＣＬＲ对ＨＬ７７０２细胞内ＧＳＫ３ｃｔ、ＧＳＫ３Ｐ及它们的磷酸化的影响。所示浓度和时间ＭＣＬＲ处理ＨＬ７７０２细胞后，免疫印迹法检测ＧＳＫ３ｏｕ邋Ｇｐ－ＧＳＫ３ａ以及Ｐ－ＧＳＫ３Ｐ水平，对免疫印迹法检测结果进行灰度分析后用独ｔ邋检验进行数据分析，＊，ｐ＜０．０５；＊＊，ｐ＜０．０１；ｎ＝３0逡逑Ｆｉｇ．邋４．１．３邋Ｔｈｅ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ＭＣＬＲ邋ｏｎ邋ＧＳＫ３ａ，邋ＧＳＫ３ｐ，邋ｐ－ＧＳＫ３ａ邋ａｎｄ邋ｐ－ＧＳＫ３ｐ邋ｉｎ邋ＨＨＬ７７０２邋ｗｅｒｅ邋ｅｘｐｏｓｅｄ邋ｉｎ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ邋ｏｆ邋ＭＣＬＲ邋ｆｏｒ邋３０邋ｍｉｎ，邋１邋ｈ邋ａｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ邋ｂｅｆｏｒｅ邋ＧＳＫ３ａ，邋ＧＳＫ３Ｐ，邋ｐ－ＧＳＫ３ａ邋ａｎｄ邋ｐ－ＧＳＫ３ｐ邋ｗｅｒｅ邋ｅｘａｍｉｎｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ．邋Ｔｈｅ邋ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｙ邋ｗａｓ邋ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ邋ｔｏ邋ｏｂｔａｉｎ邋ｈｉｓｔｏｇｒａｍ邋ａｎｄ邋ｔｈｅ邋ｓｉｇｎｉｆｉｗｅｒｅ邋ａｎａｌｙｚｅｄ邋ｂｙ邋ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ邋ｓａｍｐｌｅ邋ｔ－ｔｅｓｔ，邋＊，邋ｐ＜０．０５；邋＊＊，邋ｐ＜０．０１；邋ｎ＝３．逡逑４．１．４邋ＭＣＬＲ对ＨＬ７７０２细胞中ＧＳ的影响逡逑胰岛素信号通路中，ＧＳＫ３可以催化其底物ＧＳ磷酸化而抑制其糖原合性［５（）１。免疫印迹结果（图４．１．４）显示，不同浓度ＭＣＬＲ处理ＨＬ７７０２不同时细胞内ＧＳ总蛋白含量均无明显影响，而ｐ－ＧＳ呈现浓度依赖性升高趋势，不具有统计学意义。表明在染毒６ｈ之内，ＧＳ的活性状态基本没有特别明

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