脂酰化对抗菌肽camel抗黑色素瘤活性的影响研究

发布时间：2020-08-09 12:03

【摘要】：黑色素瘤是最常见的皮肤癌之一,由于目前用于治疗黑色素瘤的药物不仅容易产生耐药性,而且对转移后黑色素瘤效果不显著,因此黑色素瘤治疗的成功率相对较低。开发新型的黑色素瘤治疗药物仍面临着巨大的挑战。抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)是一类阳离子生物防御多肽,具有多种生物活性,如抗菌活性、抗肿瘤活性以及免疫调节活性等。抗菌肽由于独特的破膜机制而受到广泛关注。Camel是由抗菌肽Melittin和Cecropin A的活性片段嵌合而成的一类新型抗菌肽。在前期工作中,本实验室基于camel的脂酰化构建了高效的基因运输载体。在研究中发现脂肪酸的引入会诱导camel形成纳米颗粒。由于关于纳米颗粒对抗菌肽活性的影响的研究较少,因此本论文研究了不同长度的脂肪酸(C4、C8、C12、C16)对camel的自组装活性和抗黑色素瘤活性的影响。本论文实验结果表明C12-camel和C16-camel能够在盐离子的诱导下发生自组装,并且能够形成α-螺旋结构。而camel、C4-camel和C8-camel在纯水和生理盐水中都不会发生自组装。通过透射电镜观察发现,C12-camel自组装形成球状纳米颗粒。由于十六烷酸的疏水作用抑制了肽的静电排斥作用,C16-camel自组装形成了纤维结构。由于自组装纳米结构的形成,C12-camel和C16-camel的酶解稳定性得到显著提高,而camel、C4-camel和C8-camel却在短时间被胰酶降解。尽管不同长度的脂肪酸都会提高camel的抗黑色素瘤活性,但是C16-camel达到相同的抗肿瘤效果需要更长的作用时间。这可能是因为C16-camel形成了比较稳定的纳米纤维,从而阻碍了肽与细胞膜的作用。抗菌实验也验证了这一点,由于形成了比较大而稳定的纳米纤维,导致C16-camel不能透过细菌的外壁而作用到细菌内膜,从而丧失了抗菌活性。通过作用机制的研究发现camel及其类似物都能够诱导黑色素瘤细胞的凋亡,然而对细胞膜的破坏仍然是camel及其类似物杀死肿瘤细胞的主要作用方式。本研究结果也说明自组装并没有显著改变C12-camel和C16-camel的抗肿瘤机制。接下来本论文研究了自组装对C12-camel和C16-camel的体内抗肿瘤活性的影响。结果表明camel、C12-camel和C16-camel经腹腔给药和瘤内给药之后都能够显著抑制肿瘤的生长,其中瘤内给药具有更高的治疗效果。尽管许多研究表明自组装纳米结构会提高药物的抗肿瘤效果,但是我们的研究表明自组装并没有显著提高C12-camel和C16-camel的抗肿瘤效果。这可能与破膜机制仍然是camel、C12-camel和C16-camel杀细胞的主要作用方式有关。因为破膜机制不仅使camel、C12-camel和C16-camel可以直接杀死黑色素瘤细胞,同时还会因细胞坏死引发的免疫反应而抑制黑色素瘤的生长。总之,本论文的研究表明十二烷酸和十六烷酸可以使具有双亲性结构的抗菌肽camel在生理盐水中发生自组装。尽管脂肪酸会提高camel的抗肿瘤活性,但是并没有改变camel以破膜为主的抗肿瘤机制。虽然C12-camel和C16-camel会形成纳米结构,但是并没有显著提高C12-camel和C16-camel的体内抗肿瘤活性。尽管如此,本论文的研究为自组装抗菌肽的抗肿瘤应用提供了一些有价值的理论参考。
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R96
【图文】：

兰州大学,硕士学位论文,黑色素瘤,酰化

不同药物在黑色素瘤治疗中的作用机制[9]

结构分类,β-折叠,α-螺旋,无规则

直接相互作用使基因的表达上调或下调，或通过抑制翻译影响蛋白质合成。目前，人们已经从各种各样的生物体中提取出抗菌肽，并且许多抗菌肽还具有抗肿瘤、调节免疫、治疗感染和炎症的作用[13]。抗菌肽是一种 5 个到 100 多个氨基酸残基组成的小分子[14]。由于所带电荷、序列同源性、功能相似性和三维结构等性质的不同，这些分子在形态和结构上存在差异。抗菌肽根据理化性质可分为阴离子、阳离子和两亲性的多肽[15]。根据其二级结构的不同，抗菌肽可分为四大类：α-螺旋、β-折叠、环状和无规则卷曲肽（例如吲哚基）[16, 17]，如图 1-2 所示，其中最为常见的是α-螺旋和β-折叠结构[14]。典型的螺旋结构抗菌肽中，亲水性残基沿着一侧对齐，而疏水性残基沿着另一侧对齐，这种两亲性有助于抗菌肽与生物膜相互作用，这是抗菌肽的一个显著特征。研究表明抗菌肽对多种不同类型的肿瘤细胞都具有杀灭特性，它们对肿瘤细胞（如肿瘤细胞的细胞质膜）具有很高的特异性，而对正常细胞的毒性较低。能够杀死肿瘤细胞的抗菌肽分为两类：第一类包括对细菌和肿瘤细胞都有很强作用的多肽，但对哺乳动物正常细胞无效；第二类包括对细菌、癌细胞和哺乳动物正常细胞有细胞毒性的多肽[18]。

抗菌肽,作用机理

图 1-3 抗菌肽作用机理概述[17]。2.2.2 抗菌肽的非膜裂解机制越来越多的研究发现，有一些抗菌肽可以在不破坏膜完整性的情况下杀死细菌，在低浓度下它们主要通过抑制 DNA、RNA 或蛋白质合成杀死细胞。例如，已经证明 Buforin II 在细菌细胞内扩散，攻击 DNA 和 RNA 而不破坏细胞膜[20]。2.3 抗菌肽抗肿瘤的优点（1）易于合成。抗肿瘤多肽一般都不超过 50 个氨基酸，因此它们可以快速合成并易于修饰。（2）具有较高的特异性和选择性。可以针对性的杀死肿瘤细胞，但对正常组织细胞毒性较小。如 Lehmann 等人发现从蟾蜍的皮肤中分离得到的抗菌肽Magainin II 对人膀胱癌细胞有细胞毒性，但对人或小鼠成纤维细胞无细胞毒性，Magainin 通过膜裂解机制来杀死膀胱癌细胞。（3）具有较低的细胞毒性。由于抗肿瘤多肽具有较高的特异性，它们不会

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