基于冷冻电镜技术的甲状旁腺激素受体三维结构解析及药物作用位点研究

发布时间：2020-08-09 16:14

【摘要】：G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors,GPCRs)是广泛分布于细胞表面的七次跨膜蛋白,它由胞外区(Extracellular domain,ECD)、跨膜区(Transmembrane domain,TMD)和胞内区组成。其中ECD主要和配体的识别与结合相关,配体与受体结合后可引起第六个跨膜螺旋(The 6~thh transmembrane helix,TM6)等的扭转和外移,从而为下游G蛋白提供结合空间。GPCRs可通过G蛋白和Arrestin等效应蛋白进行信号转导。B类GPCRs是体内多种激素的受体,相比于其他GPCRs家族,B类受体有一个较大的胞外区。这一特点使得B类GPCRs较难表达纯化,因此加大了该家族受体结构解析的难度。作为重要的药物靶点,B类GPCRs可以调控包括糖尿病、肥胖、骨质疏松和心血管疾病在内的多种疾病。本论文的主要研究对象1型甲状旁腺激素受体(The parathyroid hormone receptor-1,PTH1R)和2型甲状旁腺激素受体(The parathyroid hormone receptor-2,PTH2R)都属于B类GPCRs。前者主要调控机体的钙稳态和骨代谢,其功能异常可引起骨质疏松等疾病。后者主要在中枢神经表达,可调控情绪、体温、细胞增殖和心血管功能等。尽管两者在维持机体正常的生理功能中扮演着重要角色,但由于缺乏结构信息,开发靶向这两个受体的药物仍面临很大的挑战。本论文期望通过解析激活状态下的甲状旁腺激素受体与配体、Gs蛋白形成的复合物结构,阐明三者间相互作用的机制,为靶向药物开发提供指导。PTH1R复合物结构解析与药物作用位点研究中,我们对受体克隆、融合标签和表达系统进行了筛选,然后将Gs蛋白单独纯化并在受体纯化时外源加入Gs蛋白获得了复合物,但该复合物不稳定无法进行冷冻电镜收样。后来我们尝试将受体与Gs蛋白在Sf9昆虫细胞中共表达,然后加入长效激活甲状旁腺激素(Long-acting PTH,LA-PTH)进行纯化。共表达的蛋白可形成稳定的复合物,在冷冻电镜收样和数据处理分析后,我们获得了分辨率为3?的处于激活状态的LA-PTH-PTH1R-Gs复合物。该结构是首个配体-PTH1R-G蛋白复合物的结构,为研究配体与受体和受体与G蛋白间的相互作用机制提供了详细的结构信息,也为基于PTH1R结构的药物研发创造了新的机遇。在PTH2R的结构解析与药物作用位点研究中,我们通过筛选不同融合标签、受体C端截短和W突变等获得了稳定表达的受体蛋白。将受体与Gs蛋白共表达,并外源加入配体进行复合物纯化。目前,我们已经可以拿到配体-受体-Gs蛋白三聚体复合物,但该复合物还不够稳定,需要进一步优化。虽然配体-PTH2R-Gs蛋白复合物结构目前还未得到解析,但前期的筛选优化为后续的结构解析提供了基础,也可为其他GPCRs的表达纯化提供参考。除了对甲状旁腺激素受体的结构研究以外,本论文还包括对甲硫氨酰tRNA合成酶(Methionyl-tRNA synthetase,MRS)抑制剂的高通量筛选(High throughput screening,HTS)实验。该实验中我们建立了以Nano-BiT为基础的筛选模型,然后对国家化合物样品库中96000个随机选取的小分子化合物进行筛选。经过初筛、复筛、特异性实验、毒性实验和细胞增殖实验,我们最终筛选出两个IC_(50)在几十μM、毒性较小,且在细胞增殖实验中表现出明显的细胞增殖抑制作用的化合物WNN1588-A010和WNN1588-B003,为后期的功能研究和药物开发打下基础。
【学位授予单位】：中国科学院大学(中国科学院上海药物研究所)
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R91
【图文】：

示意图,示意图,药物,葡萄糖

图 1.1 经典的 G 蛋白信号转导通路示意图re1.1 Classic G protein signal transduction pathway schematic diagramPCRs GPCRs 概况PCRs 对机体激素平衡起着关键的调控作用，是一类非常重要的其的药物可用于治疗糖尿病、肥胖、精神疾病和骨疾等[25]。其成员（Calcitoninreceptor，CTR）和甲状旁腺激素受体（ParathyroidhorTHR）可调控骨更新和钙平衡，靶向这两者的药物可用于骨质疏胰岛素释放和葡萄糖稳态的胰高血糖素样受体 1（GlucagoGLP-1）和葡萄糖依赖的促胰岛素释放肽（ Glucose-depe

家族,成员,降钙素受体,胰高血糖素受体

图 1.2 B 类 GPCR 各亚家族及其成员igure1.2 Class B GPCR subfamilies and members of each one GPCRs 由降钙素受体家族、胰高血糖素受体家族、血管活性聚上腺皮质释放因子受体家族和甲状旁腺激素受体家族五个亚库 GPCR database 下载（https://gpcrdb.org/structure/statistics）。lass B GPCRs include five subfamilies which are calcitonin peptidticotropin-releasing factor receptors, glucagon receptors, vasoactivnd parathyroid hormone receptors.

序列,二硫键,多肽,受体

hCTR-sCT-Gs[33]rGLP-1R-GLP1-Gs[37]hGLP-1R-ExP5-Gs[35]RAMP1-CLR-CGRP[36]图 1.3 部分已解析的 GPCRs 全长结构Figure1.3 Part of resolved GPCRs full-length structuresB 类 GPCRs 的 ECD 序列保守度较低，只有形成 3 对二硫键的 6 个半胱氨酸和其他十个左右的保守氨基酸。这些氨基酸中有 4 个氨基酸（在 PTH1R 中编码为 D113，W118，P132 和 W154）是完全保守的。虽然 ECD 的序列保守性差，但所有的 B 类受体胞外区的基本结构都是一个由三个层间二硫键固定的三层的α-β-β-α 折叠，且多肽激活都遵循“双域模型”。[38]ECD 对于多肽配体与受体结合的高亲和性和特异性是必不可少的，目前被解析的 ECD 结构大部分是与配体结合的复合物，这表明配体的结合可以稳定受体的 ECD[29, 30, 38]。TMD 的主要功能是通过构像改变介导受体激活，同时向 G 蛋白传导信号。

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