细胞穿膜肽和转铁蛋白共修饰脂质体递送阿霉素系统及其抗脑胶质瘤的研究

发布时间：2020-08-10 14:59

【摘要】：脑胶质瘤具有生长迅速,复发率高和侵袭性强等特性,是目前死亡率最高的几类肿瘤之一。化学药物治疗是最常用的脑胶质瘤治疗手段,但是由于血脑屏障(BBB)的存在,大多数化疗药物难以穿透BBB递送进入大脑,并且药物对于肿瘤细胞不具有选择性,限制了化疗药物对脑胶质瘤的疗效。药物递送系统是解决以上问题的策略之一,其中又以具有低免疫原性、低毒性、生物可降解、高生物相容性等优点的脂质体最为适宜,脂质体表面含有丰富的官能团,能够对其改性、修饰后使其达到更优的性质,如主动靶向肿瘤细胞以及通过部分之前不能通过的生物屏障等。八聚精氨酸(R8)是一种典型的细胞穿膜肽(Cell-penetrating peptide,CPPs),具有较强的细胞膜穿透能力和较强的阳离子特性,能够与细胞表面的负电残基形成氢键,在细胞膜电势作用下穿过细胞膜。而且R8富含氨基,可以通过酰胺键与疏水基团(如脂肪酸、油酸等)连接进行修饰。转铁蛋白(Tf)是一种糖蛋白,Tf作为脑靶向配体与TfRs具有较强的亲和力,Tf修饰赋予脂质体脑肿瘤靶向能力,递送化疗药物进入脑内达到靶向治疗脑胶质瘤的目的。基于以上研究背景,本文以化疗药物阿霉素(DOX)为模型药物,构建CPPs和Tf共修饰DOX脂质体,赋予其穿过BBB、肿瘤细胞双主动靶向及高效穿膜功能,首先,利用脂质体表面的Tf介导脂质体主动靶向BBB,当脂质体与BBB足够接近的情况下在CPPs的作用下,脂质体高效穿过BBB,然后,在脑内Tf介导脂质体主动靶向脑胶质瘤细胞,同样,CPPs可以介导脂质体穿过肿瘤细胞膜,最终,将DOX送达肿瘤细胞质。本文具体围绕DOX分析方法学的建立、CPPs修饰脂质体的处方筛选及工艺优化、性质表征、CPPs和Tf共修饰脂质体的制备及抗脑胶质瘤活性研究等方面展开研究。具体研究结果如下:1.DOX分析方法学的建立:为了对DOX含量进行定量分析,本章建立了DOX体内外分析方法学,并对方法学的各项性质进行考察。首先,使用高效液相色谱(HPLC)对DOX分析方法的精密度、回收率、稳定性进行研究,建立体外分析方法学。然后,建立超高效液相色谱串联质谱法(UPLC/MS/MS)检测脑组织中DOX含量的体内分析方法学,并对方法的准确度、精密度、回收率、基质效应和稳定性进行评价。结果显示,HPLC方法可以在体外准确、精密分析脂质体中DOX的含量,方法学满足DOX体外定量分析要求;UPLC/MS/MS分析方法可以准确、精密定量分析脑组织中DOX的含量,分析方法可以排除脑组织中生物基质对DOX检测的干扰。UPLC/MS/MS分析方法学满足DOX体内定量分析的要求。2.OA-R8脂质体递送DOX系统的建立:本章对CPPs修饰脂质体的处方和工艺进行优化,以其得到理化性质最优的脂质体进行下一步修饰。使用乙醇注入法结合硫酸铵梯度法主动载药制备CPPs修饰的DOX脂质体(R8PLP),以粒径、包封率等作为评价指标对R8PLP中阳离子磷脂/OA-R8/ePC/胆固醇/DSPE-PEG2000之间的比例、阳离子磷脂种类、硫酸铵浓度及脂相/硫酸铵溶液的体积比等因素进行优化。制备R8PLP的最佳条件为DOTAP作为阳离子磷脂,DOTAP/OA-R8/ePC/Chol/DSPE-PEG=20/25/18/32/3,脂相/水相=1/10,硫酸铵浓度为250μM,搅拌速度为300 rpm,注入速度为5.5 mL/min制备R8PLP;DOX主动载药条件:选用药脂比为1/10,在pH值为7.4、温度45℃的条件下载药时间30 min,完成R8PLP的载药。3.OA-R8脂质体递送DOX系统的评价:本章主要对前文制备的R8PLP的体内外性质进行表征。首先,制备了用于脑部递送DOX的R8PLP,然后,对R8PLP的理化性质进行表征,体外抗肿瘤活性、细胞摄取进行相应评价。制备的R8PLP呈球形,表面光滑,分散性好,粒径均一,粒径大约为100 nm;R8PLP的ζ电位为14.71 mV;R8PLP在37℃和4℃条件下,在10.0%血清、PBS和去离子水中,48 h内稳定性良好;冻干后的R8PLP在37℃和4℃条件下,在10.0%血清、PBS和去离子水中,48 h内稳定性良好。DOX、LP、PLP、R8LP、R8PL对U87和GL261细胞具有显著的抗肿瘤活性,并且抗肿瘤活性具有时间依赖性;给药24 h后,R8LP、R8PL活性显著高于DOX、LP、PLP,推测OA-R8修饰可以提高DOX对U87和GL261细胞的抗肿瘤活性。最后,对R8PLP的BBB通过能力进行评价:与PLP相比,R8PLP在脑组织内蓄积效果显著,R8PLP中DOX在脑内的药时曲线下面积(AUC0.5-12h)为PLP的2.4倍。然而,R8PLP的半衰期(t_(1/2))与PLP相似(3.47 vs 3.94 h),这些结果表明,OA-R8修饰的脂质体具有更好的BBB穿透性和脑组织蓄积能力。4.Tf和OA-R8共修饰脂质体递送DOX系统的建立及评价:本章在R8PLP的基础上,讨论了Tf含量对脂质体靶向性与抗肿瘤效果的影响,建立了Tf和OA-R8共修饰脂质体递送DOX系统(Tf-R8PLP),并对其粒径、血清中的稳定性、包封率和药物体外释放性能进行评价。除此之外,分析了Tf-R8PLP的体外细胞摄取。建立了裸鼠胶质瘤模型,并评估了Tf-R8PLP的体内抗肿瘤功效。对Tf-R8PLP治疗后,药物在裸鼠体内的组织分布和裸鼠器官(包括脑、心、脏、肝、脾、肺和肾)的病理学进行评价。Tf-R8PLP的最佳制备条件为R8PLP/Tf-PEG-DSPE的摩尔比例为1/100;Tf-R8PLP的粒径为128.64 nm,ξ-电位为6.81 mV,Tf的浓度为16.15μg/mL;Tf-R8PLP具有球形结构,粒径均一,Tf-R8PLP在血清中的稳定性良好;Tf-R8PLP均呈现了控制释放行为;Tf-R8PLP具有最高的肿瘤生长抑制率,Tf-R8PLP的体内抗肿瘤活性显著高于R8PLP和DOX;Tf-R8PLP组的小鼠生存时间(25天)均比生理盐水组(20天)、DOX组(22天)和R8PLP组(24天)长,Tf-R8PLP对于脑胶质瘤的治疗具有显著的效果。综上所述,本文制备了具有BBB、肿瘤细胞双主动靶向及高效穿膜功能的DOX脂质体,该脂质体理化性质优异,在体内外均有较好的抗肿瘤效果。为治疗脑胶质的多功能脂质体的临床应用打下理论基础。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R943;R96
【图文】：

烷基化过程

是一种前体药，可以口服（pH<7.0） 1.8 h[29]。pH＞7.0 时，替莫唑胺会分解唑-4-羧胺），简称 MITC。它能够使种碱基烷基化所引起的无效错配修复 DNA 单链断裂，DNA 双链断裂，最终过程如图 1.1 所示[19]。现在有很多科学究，华中科技大学的解圆圆在“载替莫瘤的作用”等方面进行了相关研究[30]，2/M 期，抑制细胞增殖，对 C6 细胞的果[30]。虽然替莫唑胺在脑胶质瘤治疗胶质瘤患者带来希望，但是替莫唑胺存而且替莫唑胺在甲醇中极微溶，在乙醇唑胺注射液的临床应用带来了较大的

生存曲线,存活率,脑胶质瘤,化学药物治疗

DOX 是一种广谱抗肿瘤活性的蒽环类抗生素，由链霉菌产生，具有强烈的细胞毒性作用[17, 18]，是目前应用最广泛的抗癌药物之一，对核酸具有很高的亲和性，能插入核酸链的碱基对之间，抑制 DNA 的合成，从而抑制肿瘤的增长[33,34]。DOX 水溶性好，在使用过程中，不需要添加像聚氧乙烯蓖麻油或 Tween 80等助溶剂，因此，DOX 被广泛用于脑胶质瘤的治疗。Chen 等[35]使用 DOX 作为化学药物治疗脑胶质瘤，结果如图 1.2 所示。体外实验结果显示，DOX 的浓度为 100 ng/mL 时，DOX 对 C6 细胞的抑制率为~60.0%，但是，小鼠平均生存天数为 19 天，仅高于空白组 2 天（17 天），而且，DOX 组小鼠的体重明显降低。Zong 等[8]也选用 DOX 作为抗脑胶质瘤药物用于脑胶质瘤的治疗，体外实验结果显示，当 DOX 浓度为 3.125 μg/mL 时，C6 细胞的存活率为~50%，而且 C6 细胞对于 DOX 具有较强的摄取量。Gao 等[36]也使用 DOX 作为化学药物治疗脑胶质瘤，出现了相似的实验结果。

流程图,脑胶质瘤,流程

图 1.3 cRGD-RCCM 的制备和治疗脑胶质瘤流程[50]Figure 1.3 cRGD-functionalized and reversibly core-crosslinked multifunctionalPEG-PCL micelles (cRGD-RCCMs) for highly potent and targeted gliomachemotherapy[50]除此之外，Singleton 等[51]也制备了纳米胶束，负载帕比司他用来治疗脑胶质瘤。首先，在磁力搅拌下，将 P407 聚合物直接溶解到 CSF 中，制备 5%的 P407溶液，然后加入 0.5 mL 的 CHCl3，搅拌均匀后，将 CHCl3蒸发，最后，进行药物装载。结果显示，制备的胶束药物递送系统具有较好的抗脑胶质瘤效果，生存时间延长至 60 天[51]。虽然，基于胶束的 DDS 在脑胶质瘤治疗方面具有较好的效果，但是在制备胶束的过程中，均使用了有机溶剂，而在制备过程中，有机溶剂难以完全除去，这将对人体构成一定的伤害[49]。1.3.2 基于纳米粒的 DDS

【相似文献】