新型透明质酸基因传递载体的优化及其介导的乳腺癌靶向基因沉默

发布时间：2020-08-13 05:40

【摘要】：阳离子化多糖是目前较为常用的一类非病毒基因载体。尽管这类载体具备很高的核酸负载能力,能通过与电负性细胞膜的静电作用表现出高细胞转染效率,但是在体内转运中容易与血浆蛋白快速结合,从而被网状内皮系统清除。故此,提高体内转染率是基于阳离子化多糖基因治疗急需解决的难题。本课题组在前期研究中借鉴病毒基因载体的核壳结构,在透明质酸(hyaluronic acid,HA)与阳离子化官能团聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)中间引入桥链,形成具有“多糖-桥链-阳离子官能团”结构的阳离子化多糖。该修饰多糖与核酸相互作用时,阳离子官能团PEI可通过静电相互作用对DNA进行压缩,在桥链的牵引下,多糖骨架空间构象发生改变,包裹在PEI-DNA外侧形成自组装纳米囊泡结构。该纳米基因载体不仅能够显著提高体内核酸转染效率,而且具有生物相容性好、长循环和肿瘤靶向性等优点。但是,桥链的引入如何影响载体的核酸递送并未进行深入研究。基于此,本课题构建具有不同桥链长度的阳离子化透明质酸,考察其核酸递送能力的变化,以及在乳腺癌基因治疗中的应用。主要研究内容如下:1.载体的合成与表征。利用酰胺反应将PEI接枝到HA上合成HA-PEI;分别以己二胺和1,12-二氨基十二烷为桥链,将PEI接枝到HA上分别合成HA-6-PEI,HA-12-PEI。借助于核磁共振氢谱、傅里叶红外光谱等表征载体的结构;借助于纳米激光粒度仪,透射电子显微镜表征载体的粒径形态;借助于场发射扫描电子显微镜对载体中阳离子官能团的接枝率进行测定。实验结果表明成功制备得到HA-PEI,HA-6-PEI,HA-12-PEI。DNA凝胶阻滞实验表明HA-PEI,HA-6-PEI,HA-12-PEI可以成功负载DNA。基于动态光散射与圆二色谱实验表明,HA-6-PEI,HA-12-PEI负载质粒DNA后能够发生自组装。2.基于小鼠乳腺癌4T1细胞的体外水平考察。(1)为了考察HA-PEI,HA-6-PEI,HA-12-PEI体外细胞水平基因传递性能,进行了细胞增殖,细胞摄取,胞内分布,细胞转染,以及细胞摄取机制的考察。结果表明,HA-12-PEI对4T1细胞的增殖、周期、凋亡没有明显影响,HA-PEI,HA-6-PEI对细胞的周期有不同程度影响,但对增殖、凋亡无显著影响;细胞摄入6 h后载体摄取量均在90%以上;载体或载体/核酸复合物复合物在细胞摄取过程中主要通过网格蛋白介导的内吞途径且具有剂量依赖性,而经桥链修饰后还表现出一定的能量依赖性;HA-PEI,HA-6-PEI,HA-12-PEI分别负载绿色荧光蛋白表达质粒转染细胞后,能观察到明亮的绿色荧光,这说明三种载体均可以负载核酸转染至细胞并能够成功表达目的蛋白;(2)三个载体分别负载靶向程序性细胞死亡分子配体1(programmed cell death-ligand 1,PD-L1)RNAi表达质粒(shPD-L1)构建得到基因治疗纳米给药系统HA-PEI/shPD-L1、HA-6-PEI/shPD-L1和HA-12-PEI/shPD-L1,并在4T1细胞水平考察纳米给药系统的RNAi效应。HA-PEI/shPD-L1、HA-6-PEI/shPD-L1和HA-12-PEI/shPD-L1的PD-L1 mRNA表达与空白对照组相比具有显著性差异(P0.01),分别降低至7.53%、11.23%、9.40%。HA-PEI/shPD-L1、HA-6-PEI/shPD-L1和HA-12-PEI/shPD-L1的PD-L1蛋白表达量与空白对照组相比具有显著性差异(P0.01),分别降低至9.49%、11.07%、11.73%。说明HA-PEI/shPD-L1,HA-6-PEI/shPD-L1,HA-12-PEI/shPD-L1可以在体外细胞水平成功诱导RNAi效应。3.荷乳腺癌4T1细胞的BALB/c小鼠体内水平考察。(1)血液水平检测结果表明:与HA-PEI组相比,HA-6-PEI组与HA-12-PEI组红细胞凝集效应均降低,血清稳定性提高;(2)原位肿瘤抑制活性实验显示:HA-PEI/shPD-L1组,HA-6-PEI/shPD-L1组,HA-12-PEI/shPD-L1组抑瘤率分别为59.72%,66.67%,69.44%。HA-PEI/shPD-L1,HA-6-PEI/shPD-L1和HA-12-PEI/shPD-L1给药系统的PD-L1 mRNA的抑制率分别为51.21%,57.29%,63.02%,蛋白表达的抑制率分别为39.20%,50.23%,63.44%。实验结果表明,与HA-PEI/shPD-L1相比,HA-12-PEI/shPD-L1能显著抑制原位肿瘤增殖(P0.01),而HA-6-PEI/shPD-L1抑制原位肿瘤增殖活性介于两者之间。(3)抑制肿瘤转移活性显示:HA-PEI/shPD-L1组,HA-6-PEI/shPD-L1组,HA-12-PEI/shPD-L1组对乳腺癌肺转移的抑制率分别为76.06%,78.26%,86.95%。与HA-PEI/shPD-L1组相比,HA-12-PEI/shPD-L1纳米给药系统能够显著抑制小鼠乳腺癌4T1细胞的肺转移(P0.05),而HA-6-PEI/shPD-L1未有显著性差异。(4)体内安全性评价表明,与HA-PEI/shPD-L1相比,HA-12-PEI/sh PD-L1具有更好的生物相容性,HA-6-PEI/shPD-L1生物相容性介于两者之间。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R943
【图文】：

示意图,路线,示意图,甲酰胺

3 实验方法3.1 HA-n-PEI(n=0, 6, 12)的合成HA-n-PEI(n=0, 6, 12)的制备参考文献[51]，具体步骤如下：HA-PEI：称取 0.1501 g HA 溶于 15 mL 甲酰胺中，加入 0.0769 g 1-乙基-(3基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiidrochloride，EDC.HCl）和 0.0461 g N-羟基琥珀酰亚胺（N-HydroxysuccinimiS）活化 8 h，称取 0.5002 g PEI 溶于 10 mL 甲酰胺，逐滴加入到上述活溶液中，氮气保护、避光，室温搅拌 24 h，将反应溶液转移至截留分子103Da-1.4×104Da 的透析袋中，去离子水透析 48 h，冷冻干燥，得 HA-P

示意图,路线,示意图,氮气保护

图 2.2 HA-n-PEI(n=6, 12)的合成路线示意图Figure 2.2 Synthesis method of HA-n-PEI(n=6, 12)3.2 FITC 标记参考文献[60]，精密称取 0.0102 g 异硫氰酸荧光素（Fluorescein isothiocyanTC）溶于 10 mL 二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）中，加入 0.04N'-羰基二咪唑（N,N'-Carbonyldiimidazole，CDI），氮气保护、避光，室活化 4 h，加入 0.0499 g HA-n-PEI(n=0, 6, 12)，继续氮气保护、避光，室反应 24 h，反应结束后将反应液转移至截留分子量为 8×103Da-1.4×104D析袋中，去离子水透析 72 h，冷冻干燥，得 HA-n-PEI-FITC(n=0, 6, 12)。3.3 核磁共振氢谱（1H-NMR）称量 0.0149 g 待测样品溶于 0.55 mL 氘代水中，转移至核磁管中，在室质子核磁共振仪进行测定，采集样品的核磁共振波谱，用 MestReNova 核

核磁共振氢谱

图 2.3 HA-PEI 的核磁共振氢谱Figure 2.31H-NMR spectrum of HA-PEI图 2.4 HA-6-PEI 的核磁共振氢谱Figure 2.41H-NMR spectrum of HA-6-PEI

【参考文献】