【摘要】：目的骨关节炎(osteoarthritis)是一种常见的以关节软骨退行性病变为特点的疾病。治疗骨关节炎的药物中,玻璃酸钠(sodium hyaluronate,SH)因其疗效明确、副作用少而在临床中受到高度认可,然而,由于SH在关节腔中降解较快,故需给药频次过高,给治疗带来了不便。黄原胶由于其独特的性质在弥补SH易降解的缺点并具备SH治疗骨关节炎药理作用方面显示了代替SH成为治疗骨关节炎的候选药物的潜力。我们课题组研究证明了分子量为3×10~6 Da~5×10~6 Da的黄原胶可在实验性骨关节炎模型中有效地抑制关节软骨的降解。然而多糖类药物的分子量与其疗效密切相关,故我们需进一步评价不同分子量的黄原胶在实验性骨关节炎中的治疗作用。前期我们证明了低分子黄原胶(1.0×10~6 Da~1.5×10~6Da)(lower range of molecular weight of xanthan gum,LRWXG)对氧化应激条件下的软骨细胞具有保护作用,但其作用机制尚不明确。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)信号通路与软骨细胞凋亡密切相关。本实验旨在通过对兔软骨细胞MAPKs信号通路相关物质表达的测定,阐明低分子量黄原胶治疗骨关节炎的MAPKs信号通路机制。方法采用多角度激光散射法测定黄原胶的分子量;根据2015版《中国药典》,采用槐豆胶实验和红外吸收光谱法对黄原胶进行鉴定。采用Cell Counting Kit-8(CCK-8试剂盒)检测低分子量黄原胶对体外培养的分离于4周龄大小的新西兰大耳白兔软骨细胞生长与增殖的影响。设置黄原胶浓度梯度(0,10,100,500,1 000,2 000μg/mL),用含不同浓度的黄原胶的培养液对体外培养的软骨细胞进行培养。采用CCK-8对所处理的细胞的细胞活力进行检测。设计分组,包括模型组、LRWXG浓度梯度组(0,10,100,500,1 000μg/mL)、信号通路抑制剂组(SP600125,SB203580)和信号通路抑制剂加LRWXG(1 000μg/mL)组。其中SP600125和SB203580为JNK和p-38信号通路抑制剂,可以特异性阻断JNK和p-38蛋白的磷酸化进而阻断相应信号通路的激活。LRWXG分组干预24 h后,向除空白组以外的其他各组加入H_2O_2溶液,使最终浓度为0.5 mM,处理24 h,建立细胞凋亡模型。采用CCK-8检测培养细胞的存活率;采用酶联免疫吸附法(Elisa)测定细胞内肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)、环氧化酶2(COX-2)、前列腺素E2水平(PGE2)的水平;采用蛋白质印迹(Western blot)检测MAPKs信号通路相关蛋白p38、p-p38、JNK、p-JNK、Bcl-2、Bax、cleaved-caspase-3的表达水平;采用免疫荧光法检测细胞内基质金属蛋白酶(MMPs)家族成员MMP-1、MMP-13和胶原蛋白家族成员Ⅱ型胶原蛋白(COLII)的表达。结果1.样品分子量1.0×10~6 Da~1.5×10~6 Da。经别实验与红外光谱图比对,证明了纯化的样品为黄原胶。2.细胞增殖实验显示,低分子量黄原胶(10,100,500,1 000,2 000μg/mL)处理的软骨细胞的细胞活力与空白对照组没有显著性差别,说明黄原胶不会影响软骨细胞的正常生长与增值。3.CCK-8细胞活力检测结果显示,与Model组相比,LRWXG(500μg/mL)可提高软骨细胞的存活率(P0.05),LRWXG(1 000μg/mL)可明显提高软骨细胞的存活率(P0.01);与单独加抑制剂(SP600125、SB203580、SP600125+SB203580)相比,LRWXG(1 000μg/mL)加抑制剂(SP600125、SB203580、SP600125+SB203580)可明显提高软骨细胞的存活率(P0.01)。实验结果显示,LRWXG的抗凋亡作用呈现剂量依赖性,且LRWXG抗凋亡作用明显强于信号通路抑制剂。4.ELISA检测结果显示,与阴性对照组相比,H_2O_2能够明显地增加炎性因子IL-1β、TNF-α、COX-2、PGE2的水平(P0.01)。与Model组相比,LRWXG能够降低炎性因子的水平且呈剂量依赖性;除PGE2外,其他三种炎性因子在加抑制剂组中的水平与Model组无显著性差别(P0.05);而LRWXG加抑制剂组四种炎性因子水平低于(P0.05)或明显低于(P0.01)单独加抑制剂组或Model组。实验结果表明LRWXG对炎性因子的抑制作用强于MAPKs信号通路抑制剂。5.Western blot结果显示,与Model组相比,LRWXG可显著降低促凋亡蛋白p-p38、p-JNK、Bax、cleaved-caspase-3的表达水平,提高抑凋亡蛋白Bcl-2的表达水平,且该作用呈剂量依赖性;与单独加信号通路抑制剂组相比,同时加信号通路抑制剂和LRWXG(1 000μg/mL)组p-p38和p-JNK蛋白表达水平无显著性差异(P0.05),促凋亡蛋白Bax、cleaved-caspase-3的表达水平明显降低,抑凋亡蛋白Bcl-2的表达水平明显增加(P0.01)。实验结果显示,LRWXG对MAPKs信号通路蛋白抑制作用与信号通路抑制剂相同,对凋亡末端相关蛋白的抑制或促表达作用强于信号通路抑制剂。6.免疫荧光染色结果显示,与Model组相比,LRWXG能够抑制MMP-1和MMP-13的表达并增加COLII的表达,且该作用呈剂量依赖性;同样与Model组相比,单独加抑制剂组三种蛋白的表达水平并表现为:MMP-1和MMP-13的表达水平有所下降,COLII的表达水平有所升高,但是变化不明显(P0.05)。与单独加抑制剂组相比,LRWXG加抑制剂组MMP-1和MMP-13的表达有明显的下降,COLII的表达水平有明显升高(P0.01)。这些结果提示LRWXG加抑制剂对MMPs的抑制作用和对COLII的保护作用均强于MAPKs信号通路抑制剂。结论LRWXG可以通过MAPKs凋亡相关信号通路发挥作用,起到抗凋亡、保护软骨细胞的作用。
【学位授予单位】：锦州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R965
【图文】：
性状观察实验
23图 2 溶解实验 槐豆胶实验实验结果中观察到，样品与槐豆胶混合组放冷后形成橡胶而单独加样品组放冷后不形成橡胶状凝胶物，仍然是胶状结果与《中国药典》2015 年版中关于 XG 的鉴别实验中规
槐豆胶实验
【参考文献】
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本文编号：
2794853
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