化疗药物CPT-11对腹腔巨噬细胞和B1细胞的长期毒性作用研究

发布时间：2020-08-17 14:15

【摘要】：目的:CPT-11(伊立替康)是治疗肠癌的一线化疗药物。腹腔巨噬细胞与B1细胞是腹腔内最重要的两类组织定居的固有免疫细胞,两者之间相互关联,共同维护胃肠固有免疫稳态。此前的研究发现,CPT-11对肠上皮和腹腔巨噬细胞有毒害作用。经CPT-11化疗后,药物对腹腔固有免疫细胞的损伤,以及损伤后后是否可以自我修复尚不清楚。为此,在本课题中我们进行了四方面的研究:其一,检测腹腔注射CPT-11对腹腔固有免疫细胞(包括腹腔巨噬细胞和B1细胞)表型和数量的影响;其二,同品系小鼠腹腔细胞和骨髓细胞过继到CPT-11腹腔给药处理后的小鼠后,检测后者腹腔巨噬细胞和B细胞的表型和数量;其三,CPT-11灌胃处理,对腹腔巨噬细胞和B细胞数量的影响;其四,检测CPT-11腹腔给药处理对抵抗大肠杆菌Escherichia coli感染的免疫能力(生存率)的影响。旨在进一步明确CPT-11对固有免疫细胞的毒性作用,为有效减轻化疗药物的毒副作用、优化化疗方案提供实验参考数据。方法:1.动物实验:C57BL/6(6-8周龄)小鼠适应性养殖一周后,将小鼠分为3组,分别为Control组、Vehicle组和CPT-11组,其中CPT-11组腹腔注射CPT-11(200 mg/kg),Vehicle组注射等量溶剂,Control组不做处理。每组按药物处理时间分亚组,各亚组分别为6只小鼠。CPT-11处理当天记为day0。继续养殖,每天监测小鼠体重变化情况,分别在day3,day7,day14,day28,day56,分别取其腹腔细胞,经抗体标记后,利用流式细胞术检测其数量和表型。其中小鼠腹腔巨噬细胞的表面标识分子为CD11b、F4/80和MHCⅡ,B细胞的表面标识分子为CD23和CD19。2.细胞实验:取小鼠腹腔细胞,种在玻璃底的dish(5×10~5 cell/dish)中,在37℃培养箱中培养2小时至贴壁,吸弃未贴壁细胞,利用免疫荧光显微技术检测腹腔巨噬细胞的表面标识分子CD11b,F4/80和胞内转录因子GATA6的表达情况。3.细胞过继移植:取同品系正常的小鼠腹腔细胞和骨髓细胞,分别过继到经腹腔注射CPT-11处理7天后的小鼠体内。过继后三周检测腹腔巨噬细胞和B细胞的数量和比例。4.细菌感染小鼠实验:小鼠分成3组,分别为Control组、Vehicle组和CPT-11组。Control组不进行任何处理,Vehicle组腹腔注射溶剂,CPT-11组腹腔注射200 mg/kg的CPT-11悬浊液。7 d后,把亚致死剂量(1×10~9 CFU)大肠杆菌活菌悬液。每隔6 h观察一次并且记录小鼠的生存情况,连续观察4天(总共观察96 h)。5.组织化学观察:将小鼠处死后,取出大小肠立即用4%的中性福尔马林溶液固定,石蜡包埋切片后,用苏木精-伊红染色,用蔡司倒置显微镜,选择Zeiss Axio Observer D镜头彩色CCD拍照获取图片。结果:1.小鼠腹腔注射CPT-11后,其腹腔巨噬细胞表型为CD11b~+F4/80~(hi)GATA6~+的大腹腔巨噬细胞(LPMs)在一周内大量消失,但是14天后具有上述表型的细胞开始逐渐增加,说明该亚群细胞在自我恢复之中。然而,LPMs数量恢复的速度缓慢,停药后两个月(day56)LPMs的数量仅及Control或Vehicle对照小鼠LPMs数量的一半,说明CPT-11腹腔注射对腹腔巨噬细胞有明显毒性作用,并且恢复过程漫长。2.CPT-11腹腔给药后,腹腔内B1和B2细胞的数量明显下调。CPT-11处理3天后,小鼠体内B细胞比例占腹腔细胞总数的比例下降至3%。但是56天后小鼠腹腔细胞中B细胞在数量上几乎完全恢复正常。3.CPT-11腹腔注射处理一周后的小鼠进行同品系小鼠腹腔细胞和骨髓细胞过继移植。在上述细胞移植后21天,分析小鼠体内腹腔细胞的表型和细胞数量。结果显示,LPMs(CD11b~+F4/80~hii MHCⅡ~(low))的比例和数量与对照组(只经CPT-11处理的小鼠)相比都有明显增加;而CPT-11处理后移植骨髓细胞的小鼠,其LPMs与对照组相比在数量上虽然也有所增加,但无统计学差异。值得一提的是,上述两种细胞过继移植小鼠中,其SPMs(CD11b~+F4/80~lowow MHCⅡ~(hi))的比例和数量与对照组相比均无明显差异。4.随后我们观察了CPT-11腹腔给药处理是否削弱小鼠抗细菌(大肠杆菌)感染的能力。CPT-11腹腔注射的小鼠,7天后腹腔注射大肠杆菌,与细菌感染对照组和空白对照组相比其存活率明显下降。5.CPT-11灌胃对小鼠腹腔细胞同样有损伤作用。小鼠经400 mg/kg CPT-11连续灌胃两次后,在day3检测到腹腔巨噬细胞(LPMs和SPMs)和B细胞的比例虽然没有明显减少,GATA6阳性细胞的比例也没有明显变化,但是腹腔细胞的总数与正常对照小鼠腹腔细胞总数相比减少了约三分之一。除此之外,小鼠经灌胃处理后从第四天开始陆续死亡,死亡前(day3)的解剖实验发现,其肠道上皮出现严重的水泡样病变。另一组实验采用400 mg/kg CPT-11灌胃一次后,与对照组小鼠相比,CPT-11处理的小鼠腹腔细胞总数在day7和day14也减少到~9×10~5(与Control组相比减少了大约三分之一)。以上结果说明口服CPT-11对腹腔固有免疫细胞的损伤作用(与腹腔注射相比)稍弱,但对肠道上皮的直接损伤作用很大。结论:CPT-11对腹腔巨噬细胞和B细胞有长期毒性,并且受损的腹腔巨噬细胞和B1细胞(属于固有免疫细胞)恢复过程较慢。过继移植同品系小鼠腹腔细胞可以加快腹腔固有免疫细胞的恢复,因此有望借此方法加速化疗病人腹腔固有免疫稳态的恢复过程。
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R965
【图文】：

异构体,丁酰胆碱酯酶,代谢过程,酯酶同工酶

图 1.1 CPT-11 与 SN-38 异构体的 pH 依赖性平衡。Figure 1.1 The pH dependence of CPT-11 and SN-38 isomers is balanced. Underphysiological pH, the lactone rings of CPT-11 and SN-38 can be hydrolyzed intocarboxylic isomers. The acidic environment, mainly in the form of lactone, is theactive form of the drug.1.2 CPT-11 代谢过程CPT-11 被两种羧基酯酶同工酶（CES1 和 CES2）和丁酰胆碱酯酶在人体内水解成活性代谢物 SN-38（如图 1.2）。CES1 和 CES2 主要分布于肝、结肠、肾和血细胞，而丁酰胆碱酯酶主要存在于血浆中[16]。这些酯酶的转化主要发生在肝内，是一个相对缓慢和低效的过程，因为只有 2-5%的 CPT-11 被转化为 SN-38[17,

过程图,过程图,肝脏

图 1.2 CPT-11 的代谢和排泄过程图[6]。CPT-11 经过静脉注射到血液，部分被血液中的羧基酯酶（CES）和丁酰胆碱酯酶水解成活性代谢物 SN-38，由有机阴离子转运多肽（OATP）1B1 转运体将 SN-38 主动转运到肝脏。CPT-11 还被肝内细胞色素 P 450（CYP 450）酶，即 CYP3A4 和 CYP3A5 代谢为非活性代谢物 APC和 NPC，NPC 可以在肝脏中由 CES1 和 CES2 转换为 SN-38。或者被肝脏中的CES1/2 水解为活性形式 SN-38。SN-38 经葡萄糖醛酸氧化后，被尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶（UGT）灭活至 SN-38G，并排出胆汁中[22]。肠道细菌产生的β-葡萄糖醛酸酶可将 SN-38G 解离为 SN-38，从而导致 SN-38 的肠肝循环。Figure 1.2 Irinotecan metabolism and excretion. The prodrug irinotecan is hydrolyzed intothe active metabolite SN-38 by two isoforms of carboxylesterases (CES1 and CES2) andbutyrylcholinesterase in the human body.

腹腔,巨噬细胞,腹腔注射

图 3.1 CPT-11（200mg/kg）可以快速清除腹腔常驻巨噬细胞。C57BL/6 雌性小鼠分成五批（五个时间段），每批三组：Control 组不处理，Vehicle 组腹腔注射溶剂，CPT-11 组腹腔注射 CPT-11（CPT-11 用量按照小鼠体重 200 mg/kg 计算，注射体积 500 μL/18g），CPT-11 注射当天记为 day0。在 day3 和 day7 分别处死一批小鼠，取腹腔细胞，计数后，相应抗体染色，用流式细胞术检测其细胞表型。（A）采用 FlowJo10.0 对腹腔巨噬细胞分析过程图展示，在 CD11b 阳性细胞群中圈出 LPMs（F4/80hiMHCIIlow）和 SPMs（F4/80lowMHCIIhi）细胞群。（B）CPT-11处理 3 天和 7 天后的流式检测结果。（C）是对（B）的数据统计分析，n=6，***表示 P < 0.001；ns 表示无统计学差异。Figure 3.1 CPT-11 treatment rapidly reduced the numbers of peritonealresident macrophages. C57BL/6 were grouped according to their non-treatment

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