黄曲霉毒素M1及其与黄曲霉毒素B1共存时对人肠道上皮细胞Caco-2的毒性作用研究

发布时间：2020-08-20 06:33

【摘要】：真菌毒素污染农作物和食品的现象普遍存在,严重威胁人类健康。真菌毒素被摄入机体后,胃肠道组织首先暴露于这些真菌毒素。肠道是人体最大的消化器官,对营养物质的吸收、转运、机体健康的维持具有重要意义,同时也能抵抗有害物质进入机体后造成的损伤和功能障碍。这种屏障功能很大程度上取决于上皮细胞完整的结构和有效的功能。真菌毒素等污染物被摄入后,肠上皮细胞的暴露水平高于其他组织;并且由于肠上皮细胞的代谢活性较强,其容易受到真菌毒素更强烈的破坏。在诸多真菌毒素中,黄曲霉毒素(aflatoxins,AFs)毒性最强并且在世界范围内分布,其中黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)是哺乳动物中最强的致癌物质之一,黄曲霉毒素M1(aflatoxin M1,AFM1)是牛奶及各种奶制品中最主要存在也是目前唯一具有限量标准的真菌毒素。随着人们对牛奶及奶制品消费的增多,以及饮食结构的复杂多样化,人们暴露于AFB1和AFM1的风险不容忽视,这也可能成为食品安全风险评估的新内容。但与单独的AFB1和AFM1作用相比,二者联合作用的潜在风险和毒性机理需进一步研究揭示。因此,为了研究牛奶中特异存在的真菌毒素AFM1的毒性作用机理,以及AFM1和AFB1联合对肠上皮细胞的毒性作用,本研究首先检测了不同浓度的AFM1对分化Caco-2细胞活性的影响,并分析了Caco-2细胞暴露于AFM1后转录组水平的变化,结合本实验的结果和文献数据,探究AFM1在不显著降低细胞活性的浓度下对Caco-2细胞的毒性机理。然后探究了0.5~8μg/m L的AFM1和AFB1联合处理分化Caco-2细胞48 h后对细胞跨上皮细胞电阻值(TEER)、FITC-葡聚糖(4和40 kDa)的渗透率的影响;之后检测了紧密连接蛋白mRNA水平和蛋白水平的变化,并通过免疫染色观察紧密连接蛋白的定位情况;除此之外,还分析了AFM1和AFB1的交互作用类型;探究了AFM1和AFB1导致紧密连接蛋白亚细胞定位改变的可能机制。主要结果如下:一,AFM1的细胞毒性具有剂量效应:高于4μg/mL时显著降低细胞活性,低浓度下(0.0005和0.005μg/mL)对细胞转录本的影响极小。趋势分析表明差异基因主要富集到模块0和3两个下降的模块中。在生物学进程类中,差异基因主要富集到细胞过程和代谢过程中;在分子功能类中,差异基因主要富集到结合和催化活性上。STRING分析得出这些候选差异表达基因参与到细胞周期的调控中。筛选到的差异基因经q-PCR验证,表达趋势与RNA-seq的趋势一致。AFM1能引起Caco-2细胞周期阻滞,并且与其所用剂量有关。细胞周期的变化和分布与细胞凋亡(DNA损伤)、细胞活性降低、细胞膜损伤无关。AFM1能引起细胞周期阻滞,并且CDK1、SOS1/Akt和AMPK信号分子参与其中。二,AFM1和AFB1联合处理组的Caco-2细胞活性显著低于对照组及单独毒素处理组(p0.05)。AFM1能显著降低分化Caco-2细胞TEER值,增加分化细胞单层的通透性,且具有剂量效应。低浓度AFM1有促进紧密连接蛋白mRNA表达的趋势,高浓度的AFM1能降低分化Caco-2细胞中紧密连接蛋白mRNA水平和紧密连接蛋白丰度。TEER、FITC-葡聚糖(4和40 kDa)的渗透率和紧密连接蛋白表达量之间具有显著相关性。AFM1和AFB1单独及混合都会影响紧密连接蛋白的分布,并发现毒素处理后紧密连接蛋白出现一定程度的内化——由膜定位变为胞质定位。AFM1导致的细胞膜损伤会引起紧密连接蛋白定位的改变,并且网格蛋白介导的内吞作用可能与毒素引起的紧密连接蛋白内化现象有关。通过两部分的试验研究发现,高浓度的AFM1会导致细胞周期阻滞,另外,AFM1与AFB1共存时毒性作用被增强,导致分化Caco-2细胞之间的紧密连接被破坏,这些都表明了AFM1对分化Caco-2细胞的毒性作用。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R99
【图文】：

化学结构图

图 1-1AFB1 和 AFM1 的化学结构图Fig. 1-1 Chemical structure of AFB1 and AFM1全球范围内对粮食作物、饲料原料和饲料成品均造成严分析对畜牧行业以及动物和人的健康是极其重要的。市场 289 个 DDGS 样本中的 AFB1 污染水平进行分析发现，其中最高值为 79.60 μg/kg，2.5~20 μg/kg 梯度占比最高，016 年上半年对从沈阳、内蒙古、吉林和广西等 8 个地区 36 个成品料样品、21 个豆粕和麦麸样品、35 个玉米样中 AFB1 污染水平分析时发现，AFB1 检出率为 100%， 286.44 μg/L，成品料中 AFB1 最高含量为 40.7 μg/kg（王测发现，从市场上收集的 160 份样品中 AFB1 在麦麸、豆出率都为 100%，其中麦麸样品中的超标率高达 38.1%，猪料和犬粮中的检出率分别为 95.5%和 88.9%（龚阿琼

气候情景,玉米,风险

AFB1 检出率为 16.4%，并且玉米污染最为严重，其中 2013 年期间有 21.7%的样品超过限量（Pleadin et al., 2015）。在 2010~2014 年，对意大利两大地区饲料中的 AFB1污染监测表明 AFB1 对饲料的污染情况呈季节性和年度性变化，而且是与气候因素极其相关（Vita et al., 2016）。在对伊朗 210 个奶牛饲料样品进行检测时，从 88 个样品中检测出 AFB1，检出率为 41.9%，污染水平 1.87~19.41 μg/ kg，其中 70 个样品（33.3%）中的 AFB1 含量高于伊朗国家标准和欧盟委员会的限制（5 μg/kg）；苜蓿干草和玉米青贮的检出率分别为 55.7%和 25.7%（Ehsani et al., 2016）。并且有研究利用建模方式预测未来100年在全球气温+ 2°C和+ 5°C情况下玉米和小麦作物中AFs 的污染，揭示了 AFB1 将成为未来欧洲玉米的食品安全问题（Battilani et al.,2016）；AFs 对玉米和小麦的污染预测的地理参考网格点绘图分别如图 1-2 和图 1-3所示。在当前环境中，AFs 污染区域主要低于北纬 45°，温度的升高明显扩大了玉米被污染的区域；在+ 5°C 的环境中，预测玉米被 AFs 污染的区域高达北纬 60°，比当前玉米种植区的北部地理分布更广。

气候情景,风险,小麦,污染水平

图 1-3 当前、+ 2°C、+ 5°C 这 3 种不同气候情景下，小麦中 AFs 污染的风险（Battilani et al.,2016）Fig. 1-3 Risk maps for aflatoxin contamination in wheat at harvest in 3 different climatescenarios, present, +2 °C, +5 °CAFM1 被国际癌症研究机构（IARC）列为 2B 类致癌物（IARC, 2002）。它是全球范围内在牛奶中唯一确定最大残留限量的真菌毒素：中国和美国为 0.5 μg/kg；欧盟（UN）、瑞士和土耳其的限量为 0.05 μg/kg。一些国家也对特定人群（例如婴儿和 3 岁以下儿童）的特定乳制品中的 AFM1 污染水平发布了不同的限量标准（Iqbalet al., 2015），如表 1-1 所示。牛奶和奶制品中 AFM1 含量的监测一直是各国关注的重点。在对欧洲、拉丁美洲、非洲及亚洲大部（东亚、中亚、南亚地区）的牛奶及奶制品 AFM1 污染水平的综合统计分析发现，南亚国家和非洲国家的样品中 AFM1的检出率和污染水平最高，持续监测动物饲料中的 AFs 污染水平极其重要以及在这些国家必须实施严格的真菌毒素限量法规（Iqbal et al., 2015）。Zheng（Zheng et al.,

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