亚甲蓝通过增强血红素加氧酶-1的蛋白表达和活性发挥对RAW264.7细胞氧化损伤的保护作用

发布时间：2020-08-20 09:22

【摘要】：亚甲蓝(methylene blue,MB)是一种吩噻嗪盐,临床上用来治疗高铁血红蛋白血症及氰化物中毒等。现有研究表明,MB具有抗氧化和线粒体保护的作用,可减轻缺血再灌注引起的氧化损伤,并且MB线粒体保护的分子机制与上调Nrf2/ARE基因有关。HO-1作为Nrf-2的下游产物,是细胞防御中的关键酶,能减少伤害性刺激诱导的炎症和氧化损伤,在ROS对细胞损伤的保护中起着关键的作用。本课题的目的是研究MB在过氧化氢(hydrogen peroxide,H_2O_2)诱导的巨噬细胞RAW264.7氧化损伤中起到的保护作用,并阐明其保护作用与HO-1蛋白之间的联系。本课题以H_2O_2诱导的RAW264.7细胞建立氧化应激模型,用不同浓度的MB对细胞进行预处理和后处理。通过MTT和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)检测细胞损伤程度;通过活性氧(reactive oxygen species,ROS)浓度、H_2O_2活性、超氧化物歧化酶(superoxyde dismutase,SOD)活性和三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)生成量检测细胞的氧化损伤;同时,用高内涵细胞分析仪检测线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potentia,MMP)和细胞内钙离子浓度评价线粒体功能;最后,通过流式细胞术和测定半胱天冬酶-3蛋白表达和活性来检测RAW264.7细胞凋亡情况。结果显示,0.1和1μM浓度的MB预处理和后处理均能在H_2O_2诱导的RAW264.7细胞氧化损伤中起到保护作用,尤其是0.1μM浓度的MB预处理治疗效果最好,表现为有效减轻细胞损伤、增强线粒体功能和减少细胞凋亡。为了阐明MB在RAW264.7细胞氧化损伤中的保护作用与HO-1蛋白之间的联系,首先对HO-1蛋白表达和活性进行检测,结果显示0.1和1μM浓度的MB预处理和后处理均能增加RAW264.7细胞中HO-1的蛋白表达水平。然后利用HO-1 siRNA以及HO-1活性抑制剂锌原卟啉抑制HO-1蛋白表达和酶活性。结果显示,HO-1 siRNA和锌原卟啉明显降低了MB在抵御H_2O_2诱导的细胞损伤、氧化应激和线粒体损伤中的有益作用,说明了MB对H_2O_2诱导的细胞氧化损伤的保护作用主要依赖于HO-1。总之,MB通过上调HO-1的蛋白表达和酶活性减轻H_2O_2诱导的RAW264.7细胞氧化损伤。
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R965
【图文】：

江南大学硕士学位论文程发展中的重要性。临床研究发现 ARDS 患者呼出气中可直接检测到 H2O2，并且血浆中的脂质过氧化酶也明显升高。另外 ARDS 患者体内抗氧化防御分子包括 SOD、过氧化氢酶等酶、谷胱甘肽和维生素 E 和维生素 C 等含量随着 ROS 水平的增加而下降。实验表明清除多余的 ROS 可以减轻内毒素引起的 ALI[10，11]。因此，适当的氧化剂-抗氧化剂平衡对治疗氧化应激导致的肺部血管内皮屏障功能障碍至关重要，所以减少 ROS 的过量产生和增加抗氧化能力成为治疗 ALI/ARDS 的重要途径。作为机体免疫反应的一部分，巨噬细胞对先天免疫和宿主防御至关重要，肺泡巨噬细胞（alveolar macrophage,AM是肺组织中数量最多的非实质性细胞，是肺组织固有免疫系统的第一道防线和氧化损伤启动的关键因素，因此抑制肺泡巨噬细胞内 ROS 的产生对治疗由氧化介质诱导的 ALARDS 具有重要意义。

图 1-4MB 化学结构及氧化还原平衡Figure 1-4 Chemical structure and redox balance of MB加氧酶-1 概述加氧酶（heme oxygenase, HO）酶系是近年的研究热点，涉及到基础发病机理等研究领域。血红素加氧酶是血红素氧化分解代谢的限速酶生一氧化碳（carbon monoxide, CO），游离铁离子以及胆绿素，胆绿为胆红素。HO-1 代谢产物 CO、胆红素、铁蛋白均具有较强的抗炎、 HO-1 在各种有害因素诱导的急性肺损伤等疾病中有重要保护作用，抗氧化介质[28]。迄今为止，发现在哺乳动物体内共有三种血红素加氧-1、HO-2 和 HO-3，分别由不同基因编码, HO- 1 属于诱导型，广泛分组织和细胞中；HO-2 属于结构型，可大量表达；HO-3 与 HO-2 结构素降解的效率很低[29]。 的基因调控 在体内大多数组织内呈低水平表达，在神经元、肝脏和脾脏中的表达但是在体内容易被多种的伤害性刺激诱导表达。HO-1 可被许多生理和

从Keap1解离并进入细胞核结合ARE区，使得HO-1的表达增加[35]（图1-2A）。在大多数的病理情况下，既有氧化应激激活Nrf-2，又有伤害性刺激导致游离血红素释放增加，两者可共同促进HO-1的转录，具有相互协同的生物学效应[36，37]。研究表明，IL10与HO-1可以相互调节。IL-10通过激活IL-10受体起作用于STAT-3信号通路，STAT-3转移到细胞核，随后诱导HO-1表达。HO-1降解血红素生成CO

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本文编号：2797810