氧化还原敏感性紫杉醇混合胶束的制备及其抗肿瘤效果研究

发布时间：2020-08-22 12:28

【摘要】：癌症仍然是全世界人类死亡的主要原因之一,在女性中,乳腺癌是最常见的癌症类型。目前,癌症的治疗方法主要包括手术,化疗,放射治疗和中医治疗。在实际治疗计划中,经常组合两种或更多种治疗以实现更好的治疗效果。使用化学药物杀死肿瘤细胞的化学疗法是最广泛使用的癌症治疗方法。但是单纯的化疗药物往往效果较差或者毒副作用大,近年来纳米技术的发展为化疗药物的递送提供了一种有效的方法。目前,纳米技术在药物输送中的应用研究主要包括三类:前药、纳米材料包载原料药、药物-材料连接复合物。综合考虑靶向递送能力以及药物控释性能,本课题选择制备药物-材料连接复合物,以紫杉醇为模型药物,通过二硫键将其与mPEG-NH2、FA-PEG-NH2相连,形成mPEG-SS-PTX和FA-PEG-SS-PTX两种药物-材料连接复合物,这两种复合物具有两亲性结构,当遇到水溶液时便发生自组装行为,形成混合胶束结构。胶束具有氧化还原敏感性和肿瘤靶向性。因为肿瘤部位存在实体瘤的高通透性和滞留效应(enhanced permeability andretention effect,EPR effect),所以胶束可以实现在肿瘤部位的聚集,随后胶束表面的叶酸(folic acid,FA)与肿瘤细胞膜表面的叶酸受体(folate receptor,FR)特异性地发生结合,通过受体介导的内吞作用将胶束内吞至肿瘤细胞中。肿瘤细胞内部谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量异常高于正常组织,因此可以进入胶束内部引起连接臂-二硫键的断裂,由此,紫杉醇原料药被释放出来并发挥抗肿瘤作用。本课题的研究内容主要包含四部分:(1)mPEG-SS-PTX和FA-PEG-SS-PTX两种药物-材料连接复合物的合成和表征;(2)mPEG-SS-PTX/FA-PEG-SS-PTX/FITC-PEG-DSPE(MFF)混合胶束的制备及其理化性质考察;(3)mPEG-SS-PTX/FA-PEG-SS-PTX/FITC-PEG-DSPE混合胶束的体外细胞实验;(4)mPEG-SS-PTX/FA-PEG-SS-PTX/FITC-PEG-DSPE混合胶束的体内分布以及抗肿瘤效果研究。主要研究过程与结果如下:(1)mPEG-SS-PTX和FA-PEG-SS-PTX两种药物-材料连接复合物的合成和表征:首先合成高反应活性的3,3'-二硫代二丙酸酐(Dithiodipropionicanhydride,DTDPA),通过核磁共振氢谱(1H-NMR)和熔点测定确认结构和熔点,并通过核磁共振氢谱法(1H-NMR)以及熔点测定法验证其结构和熔点;随后将DTDPA连接到紫杉醇2'位羟基上,得到PTX-SS-COOH,产物结构采用高效液相色谱法(HPLC)、傅里叶变换红外光谱法(FT-IR)和核磁共振氢谱法(1H-NMR)进行验证。最后将PTX-SS-COOH和mPEG-NH2、、FA-PEG-NH2相连,即得到mPEG-SS-PTX和FA-PEG-SS-PTX,产物结构通过傅里叶变换红外光谱法(FT-IR)和核磁共振氢谱法(1H-NMR)进行验证。得到的mPEG-SS-PTX和FA-PEG-SS-PTX中紫杉醇的接枝率分别为47%和74%。(2)mPEG-SS-PTX/FA-PEG-SS-PTX/FITC-PEG-DSPE混合胶束的制备及其理化性质考察:使用乳化透析法制备混合胶束,用动态光散射法(dynamic light scattering,DLS)和透射显微镜法(transmission microscopy,TEM)考察胶束的粒径、电位和形态。并使用单因素法筛选了油水相体积比、FA-PEG-SS-PTX/mPEG-SS-PTX质量比以及FITC-PEG-DSPE/FA-PEG-SS-PTX+mPEG-SS-PTX质量比对胶束的粒径、Zeta电位和形态的影响,根据结果选取了油水相体积比为2:15、FA-PEG-SS-PTX/mPEG-SS-PTX质量比为 50%、、FITC-PEG-DSPE/FA-PEG-SS-PTX+mPEG-SS-PTX质量比为10%用于后续胶束的制备,所得胶束的粒径为96.42±6.38nm,Zeta电位为-2.53±0.51。随后使用芘-荧光探针法考察了混合胶束的临界胶束浓度(critical micelle concentration,CMC),结果为0.0163mg/ml。通过透析袋法研究了混合胶束的体外释放行为。设置对照组加入lOmM D,L-二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)用于模拟肿瘤部位的高还原性环境,结果表明,添加DTT的实验组的释放速率和累积释放量显着增加。这表明胶束具有明显的氧化还原敏感性。(3)mPEG-SS-PTX/FA-PEG-SS-PTX/FITC-PEG-DSPE混合胶束的体外细胞实验:首先以人乳腺癌细胞(MCF-7细胞)为模型细胞,采用荧光显微镜法再次考察了FA-PEG-SS-PTX/mPEG-SS-PTX质量比和FITC-PEG-DSPE/FA-PEG-SS-PTX+mPEG-SS-PTX质量比对胶束摄取以及荧光成像的影响,结果显示FA-PEG-SS-PTX/mPEG-SS-PTX质量比为50%时,叶酸阳性组和阴性组的荧光亮度差别最大,说明在此比例下,FA的主动靶向性最好,所以选择FA-PEG-SS-PTX/mPEG-SS-PTX质量比为 50%。而 FITC-PEG-DSPE/FA-PEG-SS-PTX+mPEG-SS-PTX质量比为10%时,其荧光强度较20%时更强,更利于观察,所以选取FITC-PEG-DSPE/FA-PEG-SS-PTX+mPEG-SS-PTX质量比为10%。通过使用鼠黑素瘤细胞(B16细胞)和MCF-7细胞作为模型细胞来研究每个制剂组的细胞毒性,混合材料组的细胞存活率始终高于80%,表明该材料具有良好的安全性。mPEG-SS-PTX/FA-PEG-SS-PTX/FITC-PEG-DSPE混合胶束组的细胞存活率具有明显的时间依赖性和剂量依赖性,随着剂量的增加,其抗肿瘤效果比紫杉醇原料药效果要好。为了考察胶束表面叶酸的靶向性,使用流式细胞术(flowcytometry,FCM)考察了mPEG-SS-PTX/FA-PEG-SS-PTX/FITC-PEG-DSPE混合胶束对于叶酸表达水平不同的人肺癌细胞(A549细胞)和MCF-7细胞的靶向能力的差异,结果显示,MCF-7细胞中的荧光强度较A549细胞中的约强10倍,表明该胶束具有较好的叶酸靶向性。(4)mPEG-SS-PTX/FA-PEG-SS-PTX/FITC-PEG-DSPE混合胶束的体内分布以及抗肿瘤效果研究:以雌性昆明小鼠荷瘤B16细胞建立肿瘤动物模型,当肿瘤体积达到约150mm3左右时开始进行给药。每两天给药一次并测量肿瘤体积和小鼠体重,14天后处死小鼠,并取心肝脾肺肾和肿瘤组织进行苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE staining)考察胶束的生物安全性。同样方法给药一定时间后采用小动物活体成像技术(optical in vivo imaging,OI)考察胶束的体内分布情况和肿瘤靶向性。肿瘤体积变化曲线显示mPEG-SS-PTX/FA-PEG-SS-PTX/FITC-PEG-DSPE混合胶束具有良好的抗肿瘤效果。体重变化显示原料药组在治疗后期体重明显下降,但是mPEG-SS-PTX/FA-PEG-SS-PTX/FITC-PEG-DSPE混合胶束组与生理盐水组均无明显变化。HE染色显示,混合胶束组相比于原料药组和生理盐水组具有更大面积的粉红色炎症区域,表明混合胶束的良好抗肿瘤效果。而其他组织的HE染色结果显示,混合胶束组的组织相比于生理盐水组没有明显的毒副作用。综上,制备的mPEG-SS-PTX/FA-PEG-SS-PTX/FITC-PEG-DSPE混合胶束相比于原料药具有高效、低毒的抗肿瘤效果。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R943
【图文】：

图１课题设计简略图逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１邋Ａｂｓｔｒａｃｔ邋ｇｒａｐｈ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｐｒｏｊｅｃｔ逡逑２．课题主要研究内容逡逑（１）逦ＦＡ－ＰＥＧ－ＳＳ－ＰＴＸ、ｍＰＥＧ－ＳＳ－ＰＴＸ邋的合成及表征逡逑第一步是将３，３－二硫代二丙酸在乙酰氯中回流２ｈ得到对应酸酐，通过核磁逡逑共振氢谱以及熔点测定确定酸酐的结构和性质。随后将制得的酸酐与紫杉醇原料逡逑药在吡啶和ＤＭＡＰ的作用下进行酯化反应，将二硫键引入到紫杉醇的结构中得逡逑到ＰＴＸ－ＳＳ－ＣＯＯＨ，通过高效液相色谱法、红外光谱法以及核磁共振氢谱法进行逡逑结构表征。得到的邋ＰＴＸ－ＳＳ－ＣＯＯＨ邋与邋ｍＰＥＧ－ＮＨ２、ＦＡ－ＰＥＧ－ＮＨ２邋在邋ＥＤＣ、ＮＨＳ邋的逡逑作用下发生酰胺化反应合成ＰＴＸ－ＳＳ－ｍＰＥＧ和ＰＴＸ－ＳＳ－ＰＥＧ－ＦＡ，使用透析袋法逡逑

如图１－３所示，产物ＤＴＤＰＡ的核磁共振氢谱图中，２．５２邋ｐｐｍ处的为乙酰氯逡逑中的甲基氢的吸收峰；１．０３邋ｐｐｍ和３．４０邋ｐｐｍ的分别为乙醚的甲基和亚甲基氢吸逡逑收峰；两者为残留溶剂产生的吸收峰。而２．５９邋ｐｐｍ和２．９１邋ｐｐｍ的是酸酐中的亚逡逑２５逡逑

如图１－３所示，产物ＤＴＤＰＡ的核磁共振氢谱图中，２．５２邋ｐｐｍ处的为乙酰氯逡逑中的甲基氢的吸收峰；１．０３邋ｐｐｍ和３．４０邋ｐｐｍ的分别为乙醚的甲基和亚甲基氢吸逡逑收峰；两者为残留溶剂产生的吸收峰。而２．５９邋ｐｐｍ和２．９１邋ｐｐｍ的是酸酐中的亚逡逑２５逡逑

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本文编号：2800687