葡萄糖转运体介导及肿瘤微环境响应新型靶向递药系统的研究

发布时间：2020-08-26 00:16

【摘要】：肿瘤的治疗是当今社会面临的重大课题。化疗在肿瘤的治疗中占主导地位,但是化疗药物一方面存在溶解性差、生物利用度低及副作用大的缺点;另一方面,由于肿瘤细胞多药耐药现象的存在,最终导致化疗失败。肿瘤靶向递药系统(targeted drug delivery system,TDDS),能够显著提高药物溶解度及生物利用度,通过EPR效应增强在肿瘤组织的分布,并进一步通过修饰配体的作用,与肿瘤细胞过表达的受体特异性结合,增加肿瘤细胞内药物浓度,增强疗效,降低毒副作用。但是,目前TDDS仍然存在肿瘤靶向性不高,疗效提高有限等缺陷。与正常细胞相比,肿瘤细胞代谢活性显著增强,其增强的糖酵解速率需要摄取大量的葡萄糖来进行补偿,因而,肿瘤细胞表面存在葡萄糖转运体(GLUT)的过表达。与受体介导的细胞摄取相比,转运体介导的细胞摄取有更快的转运速率以及更高的特异性,因此,葡糖糖转运体是很有潜力的用于肿瘤细胞靶向递药的靶点,然而,目前基于GLUT为靶点的TDDS研究还不多。肿瘤细胞赖以生存的胞内外微环境与正常细胞也有显著差别,肿瘤细胞内谷胱甘肽(GSH)浓度比正常细胞高4倍以上,比胞外GSH浓度高5000倍以上,这种GSH分布的巨大差别可以用来实现TDDS在肿瘤细胞内的可控化释药,实现胞内药物浓度的最大化,增强药物对肿瘤细胞作用,并降低对正常组织毒性。以往的研究通过GSH敏感键交联聚合物制备TDDS,虽然能够实现GSH敏感释药的目的,但是往往需要复杂的设计及制备过程,从为数不多TDDS的成功案例分析,除了安全性和有效性外,靶向制剂制备过程的简便化和经济化也是其能否成功向临床进行转化的关键。基于此,本研究首先设计了一种安全有效且制备简便的GLUT1靶向及GSH还原敏感释药的高分子-药物偶联物TDDS,该系统以聚酰胺-胺树枝状聚合物(PAMAM)为载体,以GLUT1底物D-葡萄糖(D-glucose)为特异性靶向配体,通过聚乙二醇(PEG)与PAMAM进行偶联,喜树碱(CPT)为模型药,通过GSH敏感的二硫键连接在PAMAM上,最终合成了 Glucose-PEG-PAMAM-s-s-CPT(GPCC)偶联物。其粒径为20nm,在体外高浓度GSH环境中释药远远快于正常生理环境,具有GSH还原敏感性;在2D肿瘤细胞及3D肿瘤球模型中,与对照组相比,GLUT1高表达的HepG2细胞对GPCC偶联物的摄取增强,而GLUT1低表达的L02细胞则没有显著性差异(p0.05);GPCC偶联物与未修饰D-葡萄糖的偶联物相比,细胞毒性更强,细胞周期分析显示GPCC偶联物具有更高的S期阻滞率,细胞凋亡分析显示GPCC偶联物对细胞凋亡诱导率更高;药代动力学实验表明GPCC具有更大的最大血药浓度(Cmax)、更长的循环时间(t1/2增加),且生物利用度增加(AUC增加);在荷H22肝瘤小鼠模型上,体内外活体成像表明,GPCC偶联物在肿瘤部位聚集增加,具有明显的肿瘤靶向性;药效学实验表明GPCC能显著抑制肿瘤生长,具有更好的药效,但是体重减少最小,结合HE染色证明其对肝肾正常组织的毒性较小。肿瘤细胞多药耐药(MDR)现象是导致化疗失败的另外一个重要原因,肿瘤细胞产生多药耐药现象的原因与外排型转运体p-gp的表达增多密切相关,目前针对p-gp进行克服肿瘤MDR研究的策略主要有:药物包裹于TDDS中避免被p-gp外排;药物共递送系统,如小分子抗肿瘤药/大分子基因、化疗敏感剂/小分子抗肿瘤药、抗肿瘤药/细胞耐药抑制剂等;线粒体靶向促进细胞凋亡,如线粒体靶向给药抑制线粒体活性氧的产生、增加线粒体膜通透性、靶向Bcl-2蛋白抑制或下调细胞抗凋亡作用、靶向递送治疗基因增加促凋亡蛋白Bax和Bak的表达等。p-gp作为ATP依赖型转运体,在转运底物时需要消耗ATP,而线粒体是细胞的“能量工厂”,通过线粒体靶向,破坏线粒体功能,可切断p-gp的ATP供应,使p-gp活性降低,进而逆转多药耐药现象,目前通过切断p-gp能量供应克服多药耐药的研究还不多。此外,由于线粒体靶向通常对肿瘤细胞及正常细胞没有选择性,容易导致严重副作用,因而首先实现肿瘤细胞靶向,进一步实现线粒体靶向是较优的选择,肿瘤组织独特的微环境为实现这种“级联式”的靶向策略提供了便利。肿瘤细胞外微环境中存在基质金属蛋白酶2(MMP2)的过量表达,可以作为TDDS的一个智能化调节因子,用于改变TDDS的结构及各种理化性质,以实现TDDS特定的功能,如多级靶向。因此,我们提出通过葡萄糖配体及MMP2介导,实现级联式肿瘤细胞及线粒体靶向,破坏线粒体,降低肿瘤细胞内ATP含量使p-gp失活,从不同角度考虑克服肿瘤细胞多药耐药的问题。基于此,本研究进一步设计了一种GLUT1及MMP2介导的线粒体靶向给药系统,用于克服肿瘤MDR。模型药紫杉醇通过GSH敏感二硫键偶联在PAMAM表面,然后修饰线粒体靶向分子三苯基膦,葡萄糖化的PEG通过MMP2敏感的多肽(GPLGIAGQ)与 PAMAM 偶联,制备了 Glucose-PEG-peptide-Triphenylphosponium-PAMAM-Paclitaxel(GPp/TPP/PTXPAMAM)偶联物。对其理化性质表征表明,GPp/TPP/PTXPAMAM偶联物粒径在50 nm以内,在高浓度GSH环境中释药加快,体外释药具有GSH敏感性;粒径在MMP2酶解作用下减小,表明有MMP2敏感性,同时,通过HPLC对酶解产物进行了定性分析,证明酶敏感性的原因是由于MMP2敏感多肽GPLGIAGQ的降解;在肿瘤细胞及肿瘤球模型上进行的细胞摄取、细胞定位及细胞毒性实验表明其具有GLUT1及线粒体靶向性,更强的细胞毒性,同时肿瘤细胞耐药指数显著降低;通过线粒体膜电位和ATP含量测定,揭示其逆转耐药的作用机制可能为线粒体膜电位和胞内ATP含量的降低导致p-gp活性降低;同时Western测定表明,p-gp表达下调也是逆转MDR的重要因素;在荷MCF-7/MDR耐药乳腺癌裸鼠模型上,活体成像及药效学实验证明其有更好的肿瘤靶向性和治疗效果,以及更低的全身毒性。综上所述,本研究根据抗肿瘤药缺陷设计的两种针对GLUT1及肿瘤微环境响应的TDDS能有效提高抗肿瘤药的肿瘤靶向性和药效,并降低毒副作用,是很有潜力的TDDS。
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R943
【图文】：

葡萄糖转运体介导及肿瘤微环境响应新型靶向递药系统的研宄血管相比，其内皮细胞间隙增大，因而允许一定分子量或粒淋巴管的缺失，导致淋巴液回流受阻，从而引起粒子积聚为肿瘤增强的渗透和滞留效应（Ｅｎｈａｎｃｅｄ邋Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ邋ａｎｄ邋动ＩＥ向给药系统（Ｐａｓｓｉｖｅ邋Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ邋Ｄｒｕｇ邋Ｄｅｌｉｖｅｒｙ邋Ｓｙｓｔｅｍ，实现肿瘤靶向的靶向策略，如脂质体、胶束、纳米粒及高由于被动靶向是基于肿瘤组织生理结构特点实现的靶向，要是粒径及其在血液中的循环时间，理论上粒径在１００－２００制剂，肿瘤靶向性更好，因此，研究者通过在ＴＤＤＳ表ｅ邋Ｇｌｙｃｏｌ，邋ＰＥＧ）、透明质酸等分子的方式实现长循环的作用

ＥＰＲ）邋［１９］。被动ＩＥ向给药系统（Ｐａｓｓｉｖｅ邋Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ邋Ｄｒｕｇ邋Ｄｅｌｉｖｅｒｙ邋Ｓｙｓｔｅｍ，ＰＴＤＤＳ）即是逡逑利用ＥＰＲ效应实现肿瘤靶向的靶向策略，如脂质体、胶束、纳米粒及高分子－药物偶联逡逑物等（图２），由于被动靶向是基于肿瘤组织生理结构特点实现的靶向，因而影响其靶向逡逑能力的因素主要是粒径及其在血液中的循环时间，理论上粒径在１００－２００邋ｎｍ及循环时逡逑间较长的靶向制剂，肿瘤靶向性更好，因此，研究者通过在ＴＤＤＳ表面修饰聚乙二醇逡逑（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ邋Ｇｌｙｃｏｌ，邋ＰＥＧ）、透明质酸等分子的方式实现长循环的作用，增加肿瘤革巴逡逑向性邋ｔ２0，２Ｉｌ。逡逑晒幕＿丨0．？丨丨丨邋Ｉ逡逑肿瘤血管内皮细胞逡逑ＴＤＤＳ逡逑0邋0邋广｜＿ｉｉｉ！ｉｉＰｒｙ邋肿瘤组织逡逑图１邋ＥＰＲ效应原理示意图逡逑

本文编号：2804392