【摘要】：随着肿瘤发病率的逐年攀升,放射治疗后引起的放射性肠损伤发病率也越来越高,目前对于急性放射性肠损伤的治疗多采用综合疗法,相关药物多无针对性及特异性,且疗效欠佳,因此对于急性放射性肠损伤治疗靶点和药物的发现十分重要。已有研究表明,放射导致细胞凋亡是放射性肠炎形成的重要机制。小肠隐窝底部存在小肠干细胞,干细胞经过大约3~5天即可分化成为小肠上皮其它所有细胞,隐窝干细胞和小肠上皮细胞对放射线十分敏感,受照射后,很快发生凋亡,阻断或减少凋亡的发生有望成为急性放射性肠损伤的有效防治靶点。已有研究表明,胰高血糖素样肽-2(Glucagon Like Peptide-2,GLP-2)可修复照射引起的急性放射性肠损伤,但本实验前期发现照射后立即给予GLP-2,急性重度放射性肠损伤大鼠出现死亡时间早,死亡率高,表明单独应用GLP-2治疗效果差。caspase-3在凋亡过程中有非常重要的作用,Ac-DEVD-CHO化学结构中含有醛基,加入氧化剂后,醛基中的碳氢键断裂,氧化剂中的氧原子分别与碳和氢组成8个电子的共价键,形成更稳定的羧基,在体内更好发挥作用。因此本实验采用GLP-2和caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO联合应用来探讨其保护作用及机制。并通过GLP-2和caspase-3激动剂PAC-1联合应用反证其作用。实验方法:1.急性放射性肠损伤模型的建立大鼠麻醉后固定于自制木板上,暴露腹部,铅砖屏蔽其他部位,~(60)Coγ射线进行全腹部单次照射,剂量15Gy,建立急性放射性肠损伤模型。IEC-6细胞株,采用~(60)Coγ射线进行照射,剂量10Gy,建立急性放射性肠损伤模型。2.GLP-2和Ac-DEVD-CHO联合应用对于急性放射性肠损伤的保护作用研究Wistar雄性大鼠75只,随机将其分为对照组(C组)、单纯照射组(R组)、GLP-2组(G组)、GLP-2联合激动剂PAC-1组(P组)和GLP-2联合抑制剂Ac-DEVD-CHO组(D组)共5组,每组15只。于照射后立即分别给予生理盐水溶液、GLP-2溶液、PAC-1溶液和Ac-DEVD-CHO溶液,实验过程中对各组大鼠一般状态、体重和死亡率详细记录。分别于照射后1d、3d、5d和14d活杀取材,记录肠长度及肠重量。HE染色观察空肠、十二指肠和回肠组织结构变化及空肠绒毛长度和隐窝深度,免疫组织化学法检测空肠组织中Bmi-1的表达。选用IEC-6细胞株,照射前1h给予GLP-2溶液、PAC-1溶液和Ac-DEVD-CHO溶液,于照射后3h、6h和24h应用CCK8法检测IEC-6细胞的增殖情况。3.GLP-2和Ac-DEVD-CHO联合应用对于急性放射性肠损伤的机制研究采用原位末端标记、免疫印迹法检测空肠组织中细胞凋亡和切割caspase-3、切割PARP-1的表达,IEC-6细胞照射后3h应用流式细胞仪检测IEC-6细胞的凋亡情况。实验结果:1.GLP-2和Ac-DEVD-CHO联合应用对于急性放射性肠损伤的保护作用研究GLP-2和Ac-DEVD-CHO联合应用可显著提高照射后大鼠生存率:照射后R组在第10天开始出现死亡,死亡率15%,G组于照射后第4天出现死亡,P组于照射后第1天就出现死亡,死亡率最高,而D组无死亡。GLP-2和Ac-DEVD-CHO联合应用可减轻照射后大鼠小肠组织损伤:照射后第1天,R组出现大量凋亡细胞,G组损伤较R组轻,P组损伤较R组重,D组在所有组中损伤最轻;照射后第3天,R组肠绒毛缩短、倒伏、缺失,G组绒毛损伤及长度变化较R组轻,D组在所有组中最轻,恢复最好。照射后第5天,R组肠绒毛损伤及长度有所恢复,G组较R组轻,P组较R组重,D组在所有组中最轻,恢复最好。照射后第14天,R组肠绒毛损伤及长度恢复至正常,G组较R组恢复好,P组恢复至正常,D组较C组、R组和P组恢复好GLP-2和Ac-DEVD-CHO联合应用可减轻照射后大鼠空肠组织超微结构损伤:照射后第3天,R组出现凋亡细胞,微绒毛缺失,线粒体空化,嵴断裂,G组损伤较R组轻,P组损伤较R组重,D组损伤最轻。GLP-2和Ac-DEVD-CHO联合应用减少照射后大鼠空肠组织细胞凋亡:照射后第1天,R组凋亡细胞数显著高于C组,G组凋亡细胞数低于R组,P组显著高于R组,D组低于R组和P组,但高于G组;照射后第3天,R组凋亡细胞数显著高于C组,G组低于R组,P组接近R组,D组显著低于R组;照射后第5天,R组凋亡细胞数显著高于C组,G组低于R组,P组高于R组,D组显著低于R组;照射后第14天,R组凋亡细胞数高于C组,G组低于R组,P组低于R组,D组显著低于R组。GLP-2和Ac-DEVD-CHO联合应用增加照射后大鼠空肠组织中Bmi-1表达:照射后第1天,与C组比,R组Bmi-1的表达显著降低;与R组比,G组显著升高,D组显著升高,G组和D组均显著低于C组。照射后第3天,与C组比,R组Bmi-1的表达显著降低;与R组比,G组显著升高,D组显著低于C组。照射后第5天,与C组比,R组降低;与R组比,D组显著升高,P组显著低于C组。照射后第14天,与C组比,R组降低;与R组比,D组组织中Bmi-1的表达显著升高。GLP-2和Ac-DEVD-CHO联合应用提高照射后IEC-6细胞增殖活力:照射后3h,与C组比,R组细胞增殖活力下降;与R组比,G组增殖活力显著升高,P组增殖活力显著降低,D组增殖活力显著降低,P组和D组增殖活力也均低于C组。照射后6h,P组细胞增殖活力显著低于C组和R组。照射后24h,与C组比,R组降低;与R组比,G组和P组均显著降低,D组细胞增殖活力显著升高,也显著高于C组。2.GLP-2和Ac-DEVD-CHO联合应用对于急性放射性肠损伤的机制研究GLP-2和Ac-DEVD-CHO联合应用对照射后大鼠空肠组织中切割caspase-3和切割PARP-1的表达有影响:照射后第1天,与C组比,R组空肠组织中切割caspase-3表达升高,D组表达显著高于C组。照射后第3天,R组表达降低,G组、P组和D组表达显著降低。照射后第14天,各组的表达无差异。照射后第1天,与C组比,R组空肠组织中切割PARP-1表达升高;与R组比,P组的表达显著升高,D组的表达也显著升高。照射后第3天,与C组比,R组的表达显著升高。照射后第14天,P组的表达显著高于R组。GLP-2和Ac-DEVD-CHO联合应用减少照射后IEC-6细胞凋亡:照射后3h,与C组比,R组晚期凋亡率显著升高;与R组比,G组显著降低。照射后3h,与C组比,R组早期凋亡率显著升高;与R组比,G组和D组均降低,但无统计学差异,P组高于R组。结论:1 GLP-2和Ac-DEVD-CHO联合应用对于急性放射性肠损伤有保护作用,效果明显优于GLP-2单独应用。2 GLP-2和Ac-DEVD-CHO联合应用可能通过降低cleaved caspase-3和cleaved PARP-1的表达起保护作用。
【学位授予单位】：河北北方学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R96
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本文编号：
2805028
