CDK5介导的Tau蛋白堆积通过内质网相关降解途径引起甲基苯丙胺诱导的神经元凋亡

发布时间：2020-08-26 20:50

【摘要】：目的本研究探讨甲基苯丙胺通过内质网应激相关通路导致神经细胞凋亡的机制。方法:构建人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y和SD大鼠构建了甲基苯丙胺暴露模型。在两种模型中,应用蛋白质免疫印迹技术分别在体外和体内检测观察到甲基苯丙胺暴露引起两种磷酸化Tau蛋白(丝氨酸396位点和苏氨酸231位点)表达量的变化情况;应用免疫组织化学染色和免疫荧光染色,分别观察了两种甲基苯丙胺暴露模型磷酸化Tau蛋白的表达及分布情况;利用小干扰RNA技术和病毒感染技术分别对磷酸化Tau蛋白的上游调控因子CDK5进行敲减,观察磷酸化Tau蛋白表达的变化情况以及泛素化蛋白、蛋白酶体降解途径底物之一的CD3-δ的表达情况。观察甲基苯丙胺暴露对泛素依赖的蛋白酶体降解途径的影响。检测内质网应激信号分子磷酸化PERK以及内质网应激特异性凋亡信号分子Caspase-12的表达情况。以及敲减CDK5后,上述两种蛋白在两种暴露模型中的表达变化情况。结果:1.甲基苯丙胺暴露在体内和体外均可以引起磷酸化Tau蛋白表达的明显上调(P0.05);2.敲减CDK5可以抑制甲基苯丙胺暴露诱导的磷酸化Tau表达上调(P0.05);3.甲基苯丙胺暴露对内质网相关性降解的影响:与对照组相比,甲基苯丙胺使泛素化蛋白和CD3-δ的表达量显著增加(P0.05),当敲减CDK5之后,由甲基苯丙胺暴露引起泛素化蛋白和CD3-δ的表达显著被抑制(P0.05);4.甲基苯丙胺暴露诱导内质网应激相关的神经细胞凋亡:与对照组相比,甲基苯丙胺暴露可以导致pPERK和Caspase-12表达显著升高(P0.05),而敲减CDK5之后,这种增高的趋势明显被抑制(P0.05);在SH-SY5Y细胞甲基苯丙胺暴露模型中,对照组和单独敲减CDK5两组中,神经细胞凋亡率都在较低水平且无显著差异(总凋亡率:3.60 ±1.05%vs.3.73± 0.55%,P0.05);而敲减CDK5同时又给予甲基苯丙胺暴露可以引起细胞凋亡率较单独甲基苯丙胺暴露有显著下降(总凋亡率:18.70 ±3.91%vs.9.96± 1.20%,p0.01)结论:甲基苯丙胺暴露增加了磷酸化Tau蛋白的水平。而异常的Tau蛋白增多并堆积会破坏清除泛素化蛋白质的内质网相关降解途径,阻碍泛素依赖的蛋白酶体降解途径,进而引发非折叠蛋白反应并激活内质网应激从而诱导神经元的凋亡。然而,敲减CDK5可以抑制过表达的磷酸化Tau,恢复受损的内质网相关降解途径,然后减轻内质网应激诱导的细胞凋亡,启到保护神经元的作用。这些结果表明,甲基苯丙胺诱导的神经元凋亡与Tau蛋白过度磷酸化密切相关,可以通过敲除CDK5逆转甲基苯丙胺的神经毒性作用。通过上述研究结果,我们为以CDK5为靶点,通过抑制磷酸化Tau蛋白的异常表达,减弱甲基苯丙胺的促凋亡作用,以及为甲基苯丙胺神经毒性的分子机制提供了新的理论基础和研究思路。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R99
【图文】：

磷酸化,甲基苯丙胺,时间梯度,浓度梯度

逦博士学位论文逦逡逑ＳＨ－ＳＹ５Ｙ细胞分别设置甲基苯丙胺暴露的浓度梯度（０，邋０．５，邋１．０，１．５，邋２．０ｍＭ）逡逑和时间梯度（０，邋２，邋４，邋８，１６，邋２４小时）。对照组以等量的生理盐水代替甲基苯逡逑丙胺。用蛋白质免疫印迹技术（Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ）检测磷酸化Ｔａｕ邋（磷酸化Ｔａｕ邋Ｓｅｒ３９６逡逑和磷酸化ＴａｕＴｈｒ２３１）表达的情况。结果显示，在ＳＨ－ＳＹ５Ｙ细胞甲基苯丙胺暴逡逑露模型中，磷酸化ＴａｕＳｅｒ３９６和磺酸化ＴａｕＴｈｒ２３１的表达明显增加，并呈剂量逡逑依赖和时间依赖的特点（图１－１）。逡逑Ｆｉｇ．邋１逡逑Ｂ逦Ｃ逡逑，１．１２．ｍｍ

甲基苯丙胺,磷酸化,免疫荧光染色,蛋白表达

ｂｌｏｔ结果，我们选择最适的甲基苯丙胺暴露浓度２ｍＭ和最适暴露时间２４小时为逡逑本实验的暴露条件。结果显示，与对照组相比，甲基苯丙胺暴露组的磷酸化Ｔａｕ逡逑Ｓｅｒ３９６和磷酸化Ｔａｕ邋Ｔｈｒ２３１的表达量都有明显增高（图１－２）。蓝色颗粒显示为逡逑细胞核，绿色颗粒代表磷酸化Ｔａｕ阳性颗粒。可见，在甲基苯丙胺暴露可以使磷逡逑酸化Ｔａｕ在胞质内增多并聚集。逡逑W国逡逑图１－２邋ＳＨ－ＳＹ５Ｙ细胞甲基苯丙胺暴露模型磷酸化Ｔａｕ蛋白表达情况免疫荧光染色。蓝色颗逡逑．粒显示细胞核，绿色显示磷酸化Ｔａｕ阳性颗粒。逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋Ｔｈｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ邋ｔａｕ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｉｎ邋ＳＨ－ＳＹ５Ｙ邋ｃｅｌｌｓ邋ｅｘｐｏｓｅｄ邋ｔｏ逡逑ｍｅｔｈａｍｐｈｅｔａｍｉｎｅ邋ｗａｓ邋ｄｅｔｅｃｔｅｄ邋ｂｙ邋ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ．邋Ｔｈｅ邋ｂｌｕｅ邋ｇｒａｎｕｌｅｓ邋ｓｈｏｗｅｄ邋ｔｈｅ逡逑ｎｕｃｌｅｕｓ邋ａｎｄ邋ｔｈｅ邋ｇｒｅｅｎ邋ｃｅｌｌｓ邋ｓｈｏｗｅｄ邋ｔｈｅ邋ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ邋ｔａｕ邋ｐｏｓｉｔｉｖｅ邋ｇｒａｎｕｌｅｓ．逡逑第二节磷酸化Ｔａｕ蛋白在ＳＤ大鼠甲基苯丙胺暴露模型中的表达逡逑ＳＤ大鼠为大鼠（ｒａｔ；邋ｒａｔｔｕｓ邋ｎｏｒｒｅｇｉｃｕｓ）的一个品系，１９２５年，美国斯泼累逡逑格？多雷（ＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙ）农场用Ｗｉｓｔａｒ大鼠培育而成。其毛色白化。广泛用于逡逑药理、毒理、药效等方面的研究，也常用于研宄、评价和确定最大给药量、剂逡逑量反应和代谢以及服药后的临床和组织学检查。另外

磷酸化,甲基苯丙胺,量变,颗粒

蓝色颗粒显示细胞核；红色为神经元标志物ＮｅｕＮ阳性颗粒，显示神经逡逑元；绿色为磷酸化Ｔａｕ阳性颗粒，分布于胞质中。与对照组相比，甲基苯丙胺暴逡逑露组（１４天）两种磷酸化Ｔａｕ的表达均聚集增多（图１－４）。在免疫组化染色中，逡逑４７逡逑

【参考文献】