木犀草素联用紫杉醇对食管癌的体内外抗肿瘤作用及机制研究

发布时间：2020-08-27 20:50

【摘要】：目的1.探讨木犀草素与紫杉醇在体外联用对食管癌细胞增殖、迁移、凋亡的影响及作用机制。2.探讨木犀草素与紫杉醇在体内联用对食管癌裸鼠移植瘤生长、凋亡的影响及分子机制,并对此给药方案的潜在毒性进行初步评价。方法1.采用SRB实验检测木犀草素与紫杉醇联用对于食管癌细胞活力的影响。使用细胞增殖与示踪检测试剂盒检测木犀草素与紫杉醇联用对食管癌细胞增殖能力的影响。采用克隆形成实验检测木犀草素与紫杉醇联用对食管癌细胞克隆形成的影响。2.采用划痕实验、Transwell实验检测木犀草素与紫杉醇联用对于食管癌细胞迁移的影响;使用倒置显微镜观察木犀草素与紫杉醇联用对食管癌细胞形态的影响;采用Western Blotting实验检测木犀草素与紫杉醇联用对SIRT1及EMT相关蛋白的表达的影响。3.使用细胞凋亡检测试剂盒检测木犀草素与紫杉醇联用对于食管癌细胞凋亡的影响,使用活性氧检测试剂盒检测木犀草素与紫杉醇联用对于食管癌细胞内活性氧水平的影响,采用Western Blotting实验检测木犀草素与紫杉醇联用对线粒体凋亡通路、ROS/JNK通路相关蛋白表达的影响。4.建立食管癌细胞裸鼠移植瘤模型,检测木犀草素与紫杉醇联用对于食管癌裸鼠移植瘤生长的影响。通过HE染色及TUNEL染色实验检测木犀草素与紫杉醇联用对于食管癌细胞体内凋亡的影响。通过HE染色实验及裸鼠体重监测对两种药物联用的潜在毒性进行初步评价。通过Western Blotting实验检测裸鼠移植瘤组织中SIRT1、EMT相关蛋白、线粒体凋亡通路相关蛋白、ROS/JNK通路相关蛋白表达情况,探讨木犀草素与紫杉醇联用的体内机制。结果1.木犀草素与紫杉醇联用协同抑制食管癌细胞活力;木犀草素与紫杉醇联用协同抑制食管癌细胞增殖及克隆形成。2.木犀草素和紫杉醇联用协同抑制食管癌细胞迁移并改变食管癌细胞形态;木犀草素和紫杉醇联用协同抑制SIRT1蛋白的表达,抑制间质标志蛋白NCadherin、β-Catenin、Vimentin的表达,促进上皮标志蛋白E-Cadherin、Claudin-1、ZO-1的表达。3.木犀草素与紫杉醇联用可协同促进食管癌细胞凋亡,协同抑制抗凋亡蛋白Bcl-2、Mcl-1的表达,促进促凋亡蛋白Bax的表达,促进BH3-only死亡因子Noxa的表达,促进Cleaved Caspase-9蛋白和Cleaved Caspase-3蛋白的表达。木犀草素与紫杉醇联用可协同提高食管癌细胞内的ROS水平,协同上调p-ASK1、p-MKK4、JNK及p-JNK蛋白的表达。4.在食管癌细胞裸鼠移植瘤模型上,木犀草素与紫杉醇联用可以协同抑制裸鼠移植瘤的生长并诱导食管癌裸鼠移植瘤细胞的体内凋亡;木犀草素与紫杉醇联用对食管癌裸鼠移植瘤中SIRT1、EMT相关蛋白、线粒体凋亡通路相关蛋白、ROS/JNK通路相关蛋白的影响与体外结果基本一致。木犀草素与紫杉醇联用对裸鼠体重没有明显影响,对心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏没有明显的毒性。结论1.木犀草素与紫杉醇在体外联用时可协同调控食管癌细胞的增殖、迁移及凋亡;其抑制细胞迁移的分子机制与抑制SIRT1及细胞EMT进程相关,其诱导凋亡的机制与ROS/JNK通路和线粒体凋亡通路的激活相关。2.木犀草素与紫杉醇在体内联用时可协同抑制食管癌裸鼠移植瘤的生长、促进肿瘤细胞的体内凋亡。在治疗剂量下,两种药物联用无明显毒性。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R96
【图文】：

工作液的配制：根据样品数量，按 BCA 试剂 A 液:BCA 试剂 工作液，充分混合均匀，现用现配。定量标曲制作：根据表 2.3 中的数据将 PBS(蛋白定量专用)、A 工作液加入 96 孔板中，每个浓度设置三个复孔。表 2.3 BCA 标准曲线μg/μL） 0.0 1.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14 μL） 20.0 19.0 18.0 16.0 14.0 12.0 10.0 8.0 7.0 液（μL） 0.0 1.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0（μL） 200 200 200 200 200 200 200 200 200后将 96 孔板在 37 ℃恒温培养箱中孵育 20min。用酶标仪测 OD 值，取蛋白浓度和 OD 值曲线绘制标准曲线，得出蛋白浓 2.1。

从定影液中取出胶片，用自来水将胶片冲洗干净后，晾干。用仪扫描胶片，用光影魔术手截取条带，用 Image J 对目的条带进行灰度分析2.2.11 数据统计所有实验独立重复三次，实验结果以“平均值±标准差”形式表示。实验使用 GraphPadPrism 软件进行单因素方差分析，组间多重比较采用 Bonferro法，P<0.05 表明数据具有统计学差异。2.3 实验结果2.3.1 木犀草素单用抑制食管癌细胞活力首先，检测不同浓度的木犀草素对于食管癌 EC109 及 TE-1 细胞的细胞的影响。如图 2.2 所示，在 EC109 及 TE-1 细胞中，随着加药浓度及药物作间的增加，细胞活力逐渐降低，提示木犀草素以时间和剂量依赖方式抑制食细胞 EC109 及 TE-1 的细胞活力。

第二章 木犀草素与紫杉醇联用体外抗食管癌效果及机制研究2.3.2 木犀草素单用抑制食管癌细胞迁移肿瘤细胞转移是癌症恶化的一个危险指征。因此我们选用迁移能力强的管癌细胞 TE-1 来检测木犀草素对于细胞迁移的影响。采用划痕实验法，实验果如图 2.3 所示，与 NC 组相比，10 μM，20 μM 浓度的木犀草素能显著抑制管癌细胞 TE-1 的迁移（P<0.01）。其中，20μM 的木犀草素抑制细胞迁移能力强。

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本文编号：2806606