IgD-Fc-Ig融合蛋白对大鼠胶原性关节炎治疗作用及对T细胞IgD-IgDR-Lck-NF-κB信号通路调控

发布时间：2020-08-28 02:52

【摘要】：类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种T、B淋巴细胞参与的慢性、系统性、自身免疫性疾病。关节炎症、血管翳形成、滑膜增生、软骨和骨损伤是RA的主要病理特征。越来越多的证据表明T淋巴细胞在RA的发生和发展中起重要作用,T细胞亚群失衡和异常活化参与RA滑膜炎和免疫应答。辅助性T(helper T,Th)细胞可以促进RA关节组织破坏过程,活化的Th细胞可以通过分泌效应性细胞因子来调节这一炎症过程。目前,RA的治疗药物主要是甾体抗炎药、非甾体抗炎药、疾病调修药和生物制剂。然而,这些药物对关节炎症只有部分缓解效果,并且存在明显的胃肠道不良反应、肝脏毒性和骨髓抑制等。因而,探索新的特异性治疗靶点,开发新的治疗RA靶向药物,具有十分重要的临床意义。免疫球蛋白D(Immunoglobulin D,IgD)包括分泌型IgD(secreted IgD,sIgD)和膜结合型IgD(membrane IgD,mIgD)。虽然在体内IgD含量特别低,但在自身免疫性病中发挥着重要的免疫调节作用。临床发现,除IgD型骨髓瘤患者的sIgD水平明显升高,感染性疾病和自身免疫性疾病患者血清中的sIgD水平也较高,如RA、系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)等。这些发现引起了国内外学者对IgD在自身免疫性疾病作用的关注。高水平sIgD导致免疫性组织损伤和炎症,关节炎动物模型注射抗IgD抗体可显著缓解关节炎症。1980年在人类外周血T细胞发现有IgDR存在,而后在小鼠T细胞上也发现了IgDR。sIgD通过与IgDR特异性结合发挥免疫调节功能。实验研究发现:IgD与T细胞上IgDR相结合可致抗原特异性T细胞克隆增加。小鼠体外研究发现,蛋白酪氨酸激酶(Protein tyrosine kinase,PTK)抑制剂能抑制IgD诱导的IgDR表达,因此,我们猜想IgD可能通过PTK信号通路来诱导IgDR的表达,从而激活下游的信号通路,产生一系列的生物学效应。PTK信号通路涉及的蛋白包括Src家族的淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(Lymphocyte-specific protein tyrosine kinase,Lck)和T细胞特异的Syk家族成员zeta相关蛋白70(zeta-associated protein 70,ZAP70)。Lck主要存在于T细胞中,参与T细胞的发育、分化和活化的信号转导过程,是T细胞活化信号转导过程中最早被激活的上游信号分子之一,在介导T细胞免疫反应中起着关键性作用。在受到某些外部因素刺激时,Lck表达和活性异常,而参与RA和SLE等自身免疫性疾病。提示IgD-IgDR可能成为自身免疫性疾病的治疗新靶点,特异性阻断IgD-IgDR信号转导可能成为RA的新的治疗方法。课题组以IgD-IgDR为靶点成功将人IgD-Fc段与人IgG1-Fc段连接构成IgD-Fc-Ig融合蛋白,并已申请专利,该融合蛋白旨在特异性阻断IgD-IgDR通路,高选择性抑制T细胞异常增殖、活化和分化。课题组前期研究发现RA患者血清中IgD水平明显高于健康对照者,IgD能明显促进RA患者外周血中T细胞增殖。IgD-Fc-Ig融合蛋白明显抑制RA患者外周血中T细胞增殖。那么IgD-Fc-Ig融合蛋白对实验性关节炎有无治疗作用?IgD-Fc-Ig融合蛋白对实验性关节炎T细胞增殖、活化和分化有无影响?IgD-Fc-Ig融合蛋白能否调控T细胞上IgD-IgDR-Lck信号通路?目前尚不清楚。本课题拟以胶原诱导型关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)大鼠为研究对象,观察IgD-Fc-Ig融合蛋白对大鼠CIA的治疗作用及对T细胞增殖、活化和分化的影响,阐明IgD-Fc-Ig融合蛋白通过阻断IgD-IgDR-Lck信号通路来抑制T细胞增殖、活化和分化的机制。该研究为进一步揭示RA发病机制,阐明IgD-Fc-Ig融合蛋白治疗RA的作用特点和机制提供实验依据。目的:研究IgD-Fc-Ig融合蛋白对大鼠CIA的治疗作用,揭示IgD-Fc-Ig融合蛋白对T细胞上IgD-IgDR-Lck-NF-κB信号通路的调控作用。方法:1.Wistar雄性大鼠进行CIA模型的建立。实验分组如下:正常组(Normal group)、关节炎模型组(CIA group)、IgD-Fc-Ig融合蛋白(1、3和9 mg/kg)组和依那西普(3 mg/kg)组。每组10只大鼠。每次给药剂量都是按照大鼠体重进行计算给药,每3天给药一次,均采用尾静脉给药。给药时间为6周。正常组与CIA组根据大鼠体重采用尾静脉注射方式给予生理盐水进行平行对照。2.每3天进行一次体重、关节炎指数(arthritis index,AI)、足爪肿胀数(swollen joint count,SJC)以及足爪肿胀容积的测量和评估。计算胸腺和脾脏指数。脾脏和关节组织进行HE染色,观察病理学变化并对相关指标进行评分。CCK-8检测大鼠胸腺T细胞和脾脏B细胞的增殖能力。3.流式细胞术检测不同炎症时期大鼠外周血和脾脏细胞中T细胞亚群的百分比:CD3~+总T细胞、CD3~+CD4~+Th细胞、CD3~+CD4~+CD25~+活化的Th(activated Th)细胞、Th1(CD4~+INF-γ~+)、Th2(CD4~+IL-4~+)、Th17(CD4~+IL-17~+)和Treg(CD4~+CD25~+Foxp3~+)细胞。4.酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)和蛋白芯片技术检测大鼠血清中炎症因子IL-1β、IL-4、IL-6、IL-17、IFN-γ、TNF-α、MCP-1、Leptin和TIMP的水平变化情况。5.蛋白免疫印迹方法检测大鼠脾脏组织中Lck、p-Lck、ZAP70 p-ZAP70、P38、p-P38、NF-κB和p-NF-κB蛋白表达情况。6.体外实验:用CCK-8法检测IgD对T细胞增殖的最佳浓度以及IgD-Fc-Ig融合蛋白单独作用于正常T细胞的影响;CFSE法检测IgD-Fc-Ig融合蛋白对T细胞增殖的影响。7.流式细胞术检测IgD刺激的脾脏细胞中CD3~+总T细胞、CD3~+CD4~+Th细胞、CD3~+CD4~+CD25~+活化的Th细胞、Th1(CD4~+INF-γ~+)、Th2(CD4~+IL-4~+)、Th17(CD4~+IL-17~+)和Treg(CD4~+CD25~+Foxp3~+)细胞的百分比。8.蛋白免疫印迹方法检测IgD刺激的脾脏细胞中Lck、p-Lck、ZAP70p-ZAP70、P38、p-P38、NF-κB和p-NF-κB蛋白表达情况。结果:1.IgD-Fc-Ig融合蛋白对大鼠CIA有治疗作用分析、评估不同炎症时期CIA大鼠足爪炎症指标,结果显示IgD-Fc-Ig融合蛋白明显减轻CIA大鼠足爪肿胀。IgD-Fc-Ig融合蛋白能明显降低CIA大鼠关节炎指数、足爪肿胀数和足爪肿胀容积,恢复CIA大鼠降低的体重。2.IgD-Fc-Ig融合蛋白能够降低CIA大鼠胸腺、脾脏指数,抑制T/B细胞增殖,改善脾脏和关节病理变化相比正常组,CIA组大鼠胸腺、脾脏指数明显增加;IgD-Fc-Ig融合蛋白明显降低CIA大鼠胸腺、脾脏指数。相比正常组,CIA组大鼠胸腺T细胞和脾脏B细胞增殖反应增强;IgD-Fc-Ig融合蛋白明显抑制CIA大鼠T、B细胞增殖。脾脏病理显示:CIA组大鼠生发中心、炎性细胞浸润以及淋巴滤泡数量明显增多;IgD-Fc-Ig融合蛋白明显降低生发中心和淋巴滤泡数量,改善红髓淤血。关节病理显示:CIA大鼠关节中炎性细胞浸润、骨侵蚀以及滑膜细胞增生。IgD-Fc-Ig融合蛋白明显抑制炎性细胞浸润和滑膜细胞增生。3.IgD-Fc-Ig融合蛋白调控CIA大鼠T细胞的分化和活化流式细胞术检测不同炎症时期外周血和脾脏细胞中T细胞亚群百分比。在炎症后期,IgD-Fc-Ig融合蛋白给药组明显降低外周血淋巴细胞中CD3~+总T细胞、CD3~+CD4~+Th细胞、CD3~+CD4~+CD25~+活化的Th细胞的百分比。IgD-Fc-Ig融合蛋白明显降低脾脏细胞CD3~+总T细胞、CD3~+CD4~+Th细胞、CD3~+CD4~+CD25~+活化的Th细胞、Th1(CD4~+INF-γ~+)和Th17(CD4~+IL-17~+)细胞的百分比,增加Treg(CD4~+CD25~+Foxp3~+)细胞的百分比。IgD-Fc-Ig融合蛋白对Th2(CD4~+IL-4~+)细胞的百分比无明显影响。4.IgD-Fc-Ig融合蛋白对CIA大鼠血清中炎症因子水平的影响ELISA试剂盒和蛋白芯片技术检测大鼠血清中炎症因子IL-1β、IL-4、IL-6、IL-17、IFN-γ、TNF-α、MCP-1、Leptin和TIMP的水平变化情况。结果显示:相比正常组,CIA组大鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-17、IFN-γ、TNF-α、MCP-1和Leptin水平明显升高,TIMP水平明显降低;相比于CIA组,IgD-Fc-Ig融合蛋白明显降低IL-1β、IL-6、IL-17、IFN-γ、TNF-α、MCP-1和Leptin水平,升高TIMP水平。IgD-Fc-Ig融合蛋白对IL-4水平无明显影响。5.IgD-Fc-Ig融合蛋白下调CIA大鼠T细胞中p-Lck、p-ZAP70、p-P38和p-NF-κB65蛋白表达Western Blot结果显示:与正常组大鼠相比,CIA组大鼠脾脏细胞中p-Lck、p-ZAP70、p-P38和p-NF-κB65蛋白表达明显上调;与CIA组大鼠相比,IgD-Fc-Ig融合蛋白明显下调p-Lck、p-ZAP70、p-P38和p-NF-κB65蛋白表达。6.体外实验:IgD-Fc-Ig融合蛋白抑制IgD刺激的T细胞增殖。细胞增殖实验结果显示:IgD(9μg/ml)在48h能明显刺激T细胞的增殖,羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(5,6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester,CFSE)法检测显示:IgD-Fc-Ig融合蛋白能明显抑制IgD刺激的脾脏T细胞的增殖作用。而IgD-Fc-Ig融合蛋白单独作用对正常T细胞无明显影响。7.IgD-Fc-Ig融合蛋白调控IgD刺激的T细胞的分化和活化流式细胞术检测IgD刺激的脾脏细胞中T细胞亚群的百分比。结果显示:IgD-Fc-Ig融合蛋白明显降低IgD刺激的脾脏细胞中CD3~+总T细胞、CD3~+CD4~+Th细胞、CD3~+CD4~+CD25~+活化的Th细胞、Th1(CD4~+INF-γ~+)和Th17(CD4~+IL-17~+)细胞的百分比,增加Treg(CD4~+CD25~+Foxp3~+)细胞的百分比。IgD-Fc-Ig融合蛋白对Th2(CD4~+IL-4~+)细胞的百分比无明显影响。8.IgD-Fc-Ig融合蛋白下调IgD刺激的脾脏细胞中p-Lck、p-ZAP70、p-P38和p-NF-κB65蛋白表达Western Blot结果显示:与Control组相比,在IgD刺激的脾脏细胞中,IgD明显上调了p-Lck、p-ZAP70、p-P38和p-NF-κB65蛋白表达,与IgD(9μg/ml)组相比,IgD-Fc-Ig融合蛋白明显下调p-Lck、p-ZAP70、p-P38和p-NF-κB65蛋白表达。结论:1.IgD-Fc-Ig融合蛋白对大鼠CIA有明显的治疗作用。2.IgD-Fc-Ig融合蛋白可能通过抑制T细胞的活化、分化来调控T细胞功能。3.IgD-Fc-Ig融合蛋白可能通过调控T细胞上IgD-IgDR-Lck-NF-κB信号通路发挥对大鼠CIA治疗作用。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R965
【图文】：

脾脏指数,胸腺,融合蛋白,大鼠

安徽医科大学硕士学位论文weight of CIA rats. (F) Effect of IgD-Fc-Ig fusion protein on systemic scoring in CIArats.*p< 0.05,**p < 0.01 vs Normal;#p< 0.05 vs CIA;$P < 0.05 vs IgD-Fc-Ig (9mg/kg)(n=10).4.2 IgD-Fc-Ig 融合蛋白降低 CIA 大鼠胸腺指数和脾脏指数与正常组大鼠相比，CIA 模型组大鼠胸腺和脾脏明显肿大，指数显著升高；与 CIA 模型组大鼠相比，IgD-Fc-Ig 融合蛋白(9mg/kg)和依那西普明显降低 CIA 大鼠胸腺和脾脏指数(图 2)，依那西普对 CIA 大鼠胸腺和脾脏指数抑制作用更强。

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图 3 IgD-Fc-Ig 融合蛋白对 CIA 大鼠胸腺 T 细胞和脾脏 B 细胞增殖的影响。(A)比较各组间大鼠胸腺 T 细胞增殖的差异。(B) 比较各组间大鼠脾脏 B 细胞增殖的差异。Fig 3. Effect of IgD-Fc-Ig fusion protein on the proliferations of thymic T cells andspleen B cells in CIA rats. (A) The differences in proliferation of rat thymus T cellsbetween groups were compared. (B) The differences in proliferation of rat spleen Bcells between groups were compared.*p < 0.05 vs Normal;#p< 0.05 vs CIA (n=10).4.4 IgD-Fc-Ig 融合蛋白改善 CIA 大鼠脾脏和关节组织病理变化采用 H&E 染色法检测 CIA 大鼠脾脏和关节病理变化。取大鼠脾脏组织，经石蜡包埋、组织切片和 H&E 染色，然后在光镜下观察脾脏组织病理改变。H&E

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42图 5 IgD-Fc-Ig 融合蛋白对 CIA 大鼠不同炎症时期外周血中 T 细胞亚群的影响。(A) 比较各组间不同炎症时期大鼠外周血中CD3+总T 细胞百分比的差异。(B) 比较各组间不同炎症时期大鼠外周血中 CD3+CD4+Th 细胞百分比的差异。(C) 比较各组间不同炎症时期大鼠外周血中 CD3+CD4+CD25+活化的 Th 细胞百分比的差异。(D) 流式细胞术检测 D52 天大鼠不同炎症时期外周血中 T 细胞亚群的百分比。Fig 5. Effect of IgD-Fc-Ig on T cell subsets in peripheral blood of CIA rats atdifferent stages of inflammation. (A) The difference in the percentage of CD3+total T

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