LSD1的活性抑制对阿霉素的增敏作用及对免疫检测点PD-L1的调控作用研究

发布时间：2020-08-28 10:32

　　近年来大量文献报道:表观遗传酶组蛋白赖氨酸去甲基化酶1(LSD1)在胃癌、肺癌等肿瘤中高表达。靶向LSD1特异性抑制剂可抑制癌细胞增殖,调控基因转录抑制或者激活,并在DNA损伤修复中起重要作用。本研究旨在探索在胃癌细胞中靶向抑制LSD1的活性对DNA损伤类药物阿霉素抗肿瘤的增敏作用及其分子机制。另一方面,PD-1是一个主要表达在活化T细胞上的抑制性受体,与其配体PD-L1结合可显著抑制T细胞的活化和增殖,使肿瘤细胞逃避机体的免疫监控和杀伤。在非小细胞肺癌(NSCLCS)中存在PD-L1和LSD1异常表达,靶向PD-1和PD-L1的抗体类药物也已经证实起到良好的抗肿瘤效果。因此,本研究也同时探索在NSCLCS中PD-L1的转录表达是否受LSD1的表观调控。本课题的主要研究内容及结果如下:第一部分:LSD1的活性抑制对DNA损伤类药物阿霉素的抗肿瘤增敏作用及其分子机制1.MTT法检测细胞增殖结果显示:LSD1的抑制剂GSK-LSD1 2HCL、C26和SP2509均可明显抑制MGC-803细胞的增殖。提示LSD1的活性抑制可抑制胃癌细胞的增殖。2.流式细胞术分析细胞周期结果显示:在MGC-803和SGC-7901细胞中LSD1的不可逆性抑制剂GSK-LSD1 2HCL和SP2509均不影响细胞的周期进程,而本课题组设计的LSD1的不可逆抑制剂C26对细胞周期有一定的阻滞能力。进一步在MGC-803细胞中用si RNA靶向降低LSD1的表达,结果也不影响细胞的周期进程,提示LSD1活性抑制不影响胃癌细胞的周期进程。3.将LSD1的抑制剂2-PCPA与阿霉素(DOX)、5-Fu和顺铂等DNA损伤类药物联用的结果显示:联用组均比单用组能更明显的抑制细胞的增殖,其中2-PCPA与低剂量的DOX联用组的效果较好。4.LSD1的特异性抑制剂GSK-LSD1 2HCL与阿霉素(DOX)在细胞水平上的联用结果显示:在MGC-803和HGC-27细胞中,联用组均能显著上调促凋亡蛋白Cleaved-PARP、Cleaved-Caspase3和BAX的表达,而下调抗凋亡蛋白BCL-2的表达。进一步在MGC-803细胞中用si RNA靶向降低LSD1的表达后与DOX联用,结果仍显示联用组比单用组促凋亡蛋白Cleaved-PARP的表达增多,由此提示LSD1的活性抑制可能通过线粒体介导的内源性凋亡通路激活增敏DOX的促细胞凋亡的能力。5.LSD1的特异性抑制剂GSK-LSD1 2HCL与阿霉素(DOX)在整体动物水平上的的联用显示:联用组比单用组的瘤体积和瘤重量明显减小,且Western blot显示联用组比单用组促凋亡蛋白Cleaved-PARP的表达增多,提示体内LSD1的活性抑制也可以增强DOX的抗肿瘤活性。第二部分:LSD1对非小细胞肺癌中PD-L1的表达及其非免疫学功能的调节1.流式细胞术和Western blot的结果均可检测到NSCLCS细胞系中PD-L1表达,其中在H1975细胞中的表达明显高于其它细胞;同时还发现在H1975细胞中LSD1的表达也明显高于其它细胞,结果提示在非小细胞肺癌中PD-L1的表达与LSD1的表达可能存在一定的相关性。2.抑制LSD1的活性可显著降低H1975细胞中PD-L1的表达,且呈剂量依赖性和时间依赖性。用LSD1的si RNA靶向沉默LSD1后,PD-L1的蛋白表达量明显降低。用IFNγ预先上调PD-L1的表达水平后,抑制LSD1的活性依然可剂量依赖性和时间依赖性降低PD-L1的蛋白表达。提示LSD1活性抑制可显著下调PD-L1的蛋白表达水平,且不受肿瘤微环境的影响。3.无论是否存在IFNγ,抑制LSD1的活性均可显著降低H1975细胞中PDL1的m RNA水平。结果还显示无论是否存在IFNγ,LSD1的活性抑制均可显著降低IFNGR1的蛋白表达和m RNA水平。进一步研究发现,抑制LSD1的活性还可抑制干扰素受体介导的信号通路的活化,降低p-JAK2和p-JAK3的蛋白表达。此外,还发现抑制LSD1的活性可以通过促进P53的表达,进而抑制PD-L1的表达。4.慢病毒转染沉默PD-L1的H1975细胞与对照组相比不易发生EMT过程,且细胞的增殖、迁移和划痕修复能力降低。在H1975细胞中抑制LSD1的活性,细胞的EMT过程则不易发生,细胞的划痕修复能力降低。综上所述,LSD1的活性抑制可抑制胃癌细胞的增殖并可显著增强肿瘤细胞对DOX的敏感性。LSD1可通过调节干扰素受体IFNGR1及干扰素受体介导的信号通路和P53,调节H1975细胞中PD-L1的蛋白表达以及与肿瘤细胞相关的PD-L1的非免疫学功能。
【学位单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R96
【部分图文】：

标准曲线,标准曲线,高速离心,体积分

将上述细胞裂解液放在 4 ℃预冷的离心机中 12,000 r 高速离心 15 分的上清即为蛋白提取液。蛋白浓度标准曲线的制备：16 μl 原浓度为 5 mg/ml 的 BCA标准蛋白+144 μl 的 PBS(配置的 BCA的)配制成终浓度为 0.5 mg/ml 的 BCA标准样品。3.4 ml 的 BCA 中的 A 液+68 μl 的 BCA 中的 B 液(其中 A 液与 B 液的50:1)充分混匀后，放在冰上备用。96 孔板中加入蛋白标准品的体积分别为 0、2、4、6、8、12、16、20应各孔的 PBS 分别为：20、18、16、14、12、8、4、0 μl，每个浓副孔重复孔中加入提前配置好的 200 μl 的 BCA 溶液，然后将 96孔板放入 37 ℃育 20分钟。酶标仪的 562 nM 的波长处测得蛋白质的吸光度，并制备蛋白浓度标图：

胃癌细胞株

图 2.2 胃癌细胞株中 LSD1 存在异常表达A、B 图：检测胃黏膜上皮细胞株 GES-1 和不同分化程度的胃癌细胞株中 LSD1 的蛋白表达情况，并做统计学分析。*P< 0.05， **P<0.01，n=3，与 GES-1 细胞相比2.3.2 抑制 LSD1 的活性抑制胃癌细胞 MGC-803 的增殖我们进一步选取 LSD1 表达水平较高的 MGC-803 胃癌细胞，检测 LSD1 抑制剂对肿瘤细胞的增殖抑制作用。分别使用不同浓度梯度的 GSK-LSD1 2HCl、C26 和 SP2509 作用于 MGC-803 细胞 3 天和 6 天后，用 MTT 法检测 MGC-803细胞的存活率(如图 2.3 中图 A、B、C)。结果发现：GSK-LSD1 作用 3 天和 6天的 IC50分别为 311.03 ± 36.14 μM 和 179.97 ± 16.03 μM，C26 作用 3 天和 6天的 IC50分别为 5.512 ± 0.69 μM 和 4.5225 ± 0.71 μM，SP2509作用 3天和 6天的IC50 分别为 4.282±1.534 μM 和 4.089±3.330 μM。同时我们也通过检测 LSD1 的底物 H3K4me2 水平，分析抑制剂对 LSD1 活性的影响。分别使用不同浓度梯度的 GSK-LSD1 2HCl、C26、SP2509 作用于 MGC-803 细胞 4 天后，Western blot法检测 H3K4me2 (如图 2.3 中图 D-I)，结果发现这三种药物都可以增加

细胞周期分布,活性抑制,胃癌细胞,细胞

图 2.3 抑制 LSD1 的活性抑制胃癌细胞 MGC-803的增殖A 图：给予 GSK-LSD1 2HCl（0，15.6，62.5，250，1000 μM）作用 3 天和 6 天后检测细胞增殖；B 图中给予 C26（0，0.16，0.63，2.5，10 μM）作用 3天和 6 天后检测细胞增殖；C图：给予 SP2509(0，0.31，1.25，5，20 μM) 作用 3 天和 6 天后后检测细胞增殖；D、E 图：给予 GSK-LSD1 2HCl（0，1，10，100 μM）作用 4 天后检测 H3K4me2 的表达；F、G 图：给予 C26（0，0.1，0.3，1，3 μM）作用 4 天后检测 H3K4me2 的表达；H、I图：给予SP2509(0，0.01，0.1，1，10 μM) 作用 4 天后检测 H3K4me2 的表达，*P< 0.05，**P<0.01,n=3，与未加药组相比。2.3.3 抑制 LSD1 的活性不影响胃癌细胞的周期进展有文献报道 LSD1 参与调控 DNA损伤修复过程。为此，我们使用流式细胞术分析了 LSD1 抑制剂是否会引起细胞周期阻滞。使用不同浓度梯度的 GSK-LSD1 2HCL 和 SP2509 处理 MGC-803 细胞 4 天，用流式细胞术检测细胞周期进展情况，结果发现 GSK-LSD1 2HCL 和 SP2509 均不影响细胞周期分布(图 2.3中图 A、B) 。当使用 100 μM 的 GSK-LSD1 2HCL处理 SGC-7901 和 MGC-803 细胞 1- 6天时，依然不会引起细胞周期阻滞(图 2.3中图 C、D)。在 SGC-7901细胞中，使用 0.3 μM的 C26处理 1-3天，发现 C26

【参考文献】