HCN通道参与甲基苯丙胺神经兴奋性毒性生物学研究

发布时间：2020-09-05 08:08

　　背景与目的:甲基苯丙胺(Methamphetamine,METH),又称冰毒,目前已经成为全球第二位滥用毒品,甲基苯丙胺滥用构成我国一个日益严重的医学生物学和社会学问题,对我国的和谐社会造成了巨大的威胁~([1,2])。METH主要作用于中脑-边缘-多巴胺系统,对中枢神经系统具有兴奋作用,由于其高神经毒性和成瘾性,可以造成中枢神经系统严重损伤,而METH神经毒性作用机制之一为谷氨酸(Glutamate,Glu)兴奋性毒性。METH与多巴胺(dopamine,DA)受体结合使胞外谷氨酸浓度增加,产生兴奋性毒性,对神经元造成损伤~([3,4])。超极化激活环核苷酸门控阳离子通道(Hyperpolarizationactivated and cyclic nucleotide-gated,HCN),该通道具有调节神经元兴奋性、神经节律和突触可塑性等重要功能~([5])。前期研究表明,HCN通道可能参与了滥用物质所致神经毒性相关中枢神经系统疾病发生发展~([6-8])。METH是否作用于HCN通道,HCN通道是否有可能成为防治METH神经毒性的药物靶标。实验方法:体外实验检测HCN通道是否参与METH所致神经损伤。通过长期小剂量腹腔注射METH,建立METH所致大鼠神经损伤刻板行为模型,按照大鼠刻板行为评分标准,以大鼠出现重复的嗅探、摇头、抬头和旋转等刻板行为症状,评分结果大于或等于2分为模型建立成功,通过侧脑室给药HCN通道拮抗剂观察对神经刻板行为逆转作用。体外实验检测METH对通道蛋白表达及功能影响。METH神经损伤模型大鼠,经麻醉、灌流、断头取脑、固定,蔗糖梯度脱水后进行冰冻切片。通过免疫荧光和蛋白免疫印迹技术,观察刻板行为模型中海马和伏隔核脑区HCN1蛋白表达。采用离体脑片全细胞电流钳记录技术,向神经元细胞注射变化的电流刺激(-300 pA至50 pA,50 pA间隔)步阶刺激,经METH所致神经损伤后,记录离体脑片CA1区锥体神经元电位变化,明确甲基苯丙胺是否直接作用于HCN通道。采用离体脑片全细胞电压钳记录技术,向神经元细胞注射超极化电压步阶(-50 mV至-120 mV,10 mV间隔)刺激,给METH所致神经损伤后,观察METH对大鼠离体脑片海马CA1区HCN通道电流影响。进一步明确HCN参与调控METH所致谷氨酸神经兴奋性毒性。采用离体脑片,采用电生理Gap-Free模式,5μM METH+20μM ZD7288灌流离体脑片后,记录大鼠离体脑片CA1区锥体神经元微小兴奋性突触后电位变化。实验结果:通过实验大鼠腹腔注射10 mg/kg METH,观察到其刻板行为评分大于或等于2分,结果显示成功构建METH所致刻板行为模型。预处理HCN阻滞剂5μg/kg ZD7288侧脑室给药后,结果表明HCN通道拮抗剂ZD7288可以逆转METH导致的大鼠刻板行为。免疫荧光方法和蛋白免疫印迹法结果显示METH造模大鼠的海马、伏隔核HCN1蛋白表达上调。体外电生理结果显示METH增加HCN通道电流幅度和HCN sag膜电位。HCN降低METH所致谷氨酸兴奋性毒性,减少谷氨酸介导的微小兴奋性突触后电位。结论:HCN通道非选择性阻断剂ZD7288能逆转METH所致大鼠刻板行为,METH与HCN通道具有相关性。METH上调海马CA1区和伏隔核区HCN1亚基蛋白表达水平。METH直接作用于HCN通道,增强HCN通道功能。HCN通道阻断剂具有缓解METH所致神经元兴奋性毒性作用,HCN通道参与调控METH所致神经毒性。
【学位单位】：佳木斯大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R99
【部分图文】：

阻断剂,大鼠,通道,刻板行为

μg/kg ZD7288 后，大鼠自发活性略微增强，但无明显刻板行为，刻板行为评分为（0.8±1.2）分（见图 1A）。亚急性 10 mg/kg METH 处理能导致大鼠明显的刻板行为[65]，腹腔注射 10 mg/kg METH 后，出现明显转圈、摇头、嗅探等刻板行为表现，刻板行为评分大于2 分。其中单独给药 5 μg/kg ZD7288 组后大鼠自发活性低于1 μg/kg ZD7288 给药组，此外 5 μg/kg ZD7288 与给药 METH 组相比自发活性明显明显较低（见图 1B）（n=25，*P<0.05，单因素方差分析及 Bonferroni 检验）。因此选 5 μg/kg ZD7288 作为预处理给药剂量。HCN 通道是一类大分子膜蛋白，参与调控人体众多生理功能，HCN离子通道参与调节人体多种中枢神经系统疾病，近几年 HCN 通道作为药物作用靶点成为热点。HCN 通道功能是通过激活或抑制通道开放实现的，本实验选择 HCN 通道非选择性阻断剂 ZD7288 作为工具药抑制通道功能，影响离子通道基本电生理特性和通道自身对离子渗透的高度选择性。通过观察神经疾病病理状态下 HCN 通道表达变化，明确HCN 通道参与调控神经疾病病理生理过程，进而揭开疾病发生发展机制，同时有利于设计和开发治愈神经疾病的离子通道药物。

刻板行为,大鼠模型,阻断剂,通道

CN 通道阻断剂对甲基苯丙胺所致刻板行为的影响METH 亚急性处理组中，进行连续给药 4 天的亚急性处理。试验结果显示，给药，大鼠表现为活动增多，竖毛、竖尾、反复的向前探索、旋转、倒退等刻板行为性增强等；第 2 天、第 3 天及第 4 天大鼠给药后表现为活动相对减少，迅速旋转等刻板行为减少，症状表现多以呆滞，原地摇头、反复的向前探索等轻度刻板随着给药时间的延长，大鼠刻板行为逐渐由重度探索转为中度或轻度症状表现。H（10 mg/kg，i.p.）亚急性处理中，提前 30 min 给大鼠注射侧脑室 ZD7288（，剂量与盐水组组相同）出现减缓的急速摇头、倒退和旋转等重度症状减少或间很短的行为表现，缓解 METH 所致的刻板行为（见图 2）。(n=10, Mean±S.E一个重复测量的双因素方差分析及 Bonferroni 检验 )。结果表明，HCN 通道阻断ETH 所致神经损伤刻板行为，HCN 通道可能参与了调节 METH 引起的神经毒性通过调控HCN 通道功能可以对 METH 神经毒性进行干预。

亚基,蛋白表达,蛋白,蛋白免疫印迹

ETH 上调海马 CA1 区神经元 HCN1 亚基蛋白表达PA 染细胞核后的蓝色荧光镜像；B：METH 模型组与盐水组相比大鼠海 HCN1 亚基蛋白绿色荧光增强；C：蛋白免疫印迹显示，HCN1 亚基蛋白马 CA1 区高表达。（Mean±S.E.M.，采用独立样本 T 检验分析组间差异， METH vs.NS） 3 METH up-regulates the expression of HCN1 subunit in hippocampal Cs blue fluorescence image of nucleus stained by DIPA; B:The green fluorescencesubunit protein in hippocampal CA1 region was enhanced in METH model groed with saline group; C:The expression of HCN1 subunit protein in hippocamegion was significantly higher in protein immunoblotting. (Mean +S.E.dent sample T test was used to analyze the differences between groups,*P < 0. vs. NS)

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