麦冬多糖及其多囊脂质体的抗Ⅱ型糖尿病活性研究

发布时间：2020-09-07 09:18

　　作为全球发病率第一的慢性疾病,糖尿病严重威胁了人类的健康与生活质量。Ⅱ型糖尿病是一种异质性内分泌紊乱,其中高血糖症是统一的特征,并伴随着一些其他的并发症,例如胰岛素抵抗,高血压和血脂异常。此外,糖尿病还会导致一些死亡率高的疾病,如心血管疾病或中风。目前,治疗糖尿病的药物通常是化学合成药物和胰岛素,化学药物治疗存在很多不良反应,并且目前胰岛素只能注射,会带来很多安全隐患。近年来研究发现,从天然产物中提取的多糖,显示出具有抗糖尿病的活性,且安全无毒,有望开发成为天然降糖药。本文从不同产地的传统降糖中药麦冬中分离出治疗Ⅱ型糖尿病最佳的活性多糖组分,并初步探究其构效关系。多糖的口服生物利用度差,是导致其市场缺失的主要原因,本课题拟用多囊脂质体来包裹多糖以提高其治疗Ⅱ型糖尿病的活性。第一章综述本章节综述了Ⅱ型糖尿病药物的研究进展,并总结了生物药、化学合成药以及多糖类药物的作用机理及优缺点,重点介绍了具有降血糖活性的麦冬多糖,并展望了麦冬多糖相关制剂研究新方向。第二章不同产地麦冬多糖的提取分离及纯化本章节研究了两种产地(四川和湖北)的麦冬块根,经水提、醇沉、除蛋白得到麦冬精多糖,再通过D101大孔吸附树脂和DEAE-52纤维素阴离子交换层析柱成功从四川麦冬多糖中分离出单一多糖组分OJP-S-1,从湖北麦冬多糖中分离出两种多糖组分OJP-H-1和OJP-H-2。并对其纯度进行了一系列的鉴定,通过紫外分光光度法和蛋白质含量测定可以看出三种纯化的麦冬多糖组分OJP-S-1,OJP-H-1和OJP-H-2无蛋白质、核酸干扰,蛋白含量均小于0.2%。从高效液相凝胶色谱分析可以看出,OJP-S-1,OJP-H-1和OJP-H-2的分子量分布范围集中,无小分子物质干扰,纯度较高,且这三种组分的总糖含量均高达97%,为筛选最佳抗Ⅱ型糖尿病活性的麦冬多糖组分奠定了基础。第三章麦冬多糖不同组分抗Ⅱ型糖尿病活性研究与结构解析本章节成功建立了STZ诱导的Ⅱ型糖尿病小鼠模型,比较了三种麦冬多糖组分(OJP-S-1、OJP-H-1和OJP-H-2)在相同剂量下(200 mg/kg)抗Ⅱ型糖尿病的效果。与模型组相比OJP-S-1,OJP-H-1和OJP-H-2均能显著降低Ⅱ型糖尿病小鼠的空腹血糖水平(p0.01),有效改善口服葡萄糖耐量(p0.01),并缓解胰岛素抵抗症状,表明这三种麦冬多糖组分均有一定的降血糖效果。比较这三组的结果可以发现,OJP-S-1要比OJP-H-1和OJP-H-2的降血糖效果更明显。由于多糖的结构与药效之间存在一定的关系,多糖的分子量、单糖组成、糖苷键类型、支链、异头碳构型和高级结构与其活性具有高度的关联性。本章对三种麦冬多糖组分的初步结构进行了解析,并结合其抗Ⅱ型糖尿病的效果初步探讨分析了构效关系。结构解析发现OJP-S-1组分有着发挥其降糖活性所需的更合适的分子量,还原性糖苷键(1→3)的比例更高,并且同时具有α和β构型,这些结构使得OJPS-1组分具有更加明显的抗Ⅱ型糖尿病的活性。第四章麦冬多糖多囊脂质体的处方工艺研究及质量评价麦冬多糖是水溶性药物,稳定性较差、生物利用度不高以及对某些细胞穿透能力不强,这些都限制了它的临床应用,因此本文选取了适合水溶性大分子物质的多囊脂质体制剂来解决这些问题。本章节拟用抗Ⅱ型糖尿病活性最佳的多糖组分OJP-S-1,建立了苯酚硫酸法测定麦冬多糖含量的分析方法,并进行了方法学考察。结果表明,该分析方法,系统适用性好;在0.1-1 mg/mL范围内线性关系良好;日内及日间精密度的RSD值均小于2%;方法回收率高(RSD3%),可用于麦冬多糖OJP-S-1的定量分析。以复乳法制备麦冬多糖多囊脂质体(OJPMVLs),单因素法筛选处方,Box-Behnken响应面设计法优化处方,优选的处方为麦冬多糖OJP-S-1 24 mg,维生素E 5 mg,DOPC 20 mg,DPPG 4 mg,胆固醇16 mg,三油酸甘油酯10 mg,吐温80 10 mg,制得的麦冬多糖多囊脂质体包封率高(81.24±2.11%)。体外表征表明,制备的多囊脂质体呈圆形,粒度圆整,大小均一,每个多囊脂质体由许多小囊泡堆积而成,多室结构清晰可见。平均粒径为15.37μm,粒径分布范围较窄,Zeta电位为-38.38±3.26 mV。麦冬多糖多囊脂质体初步稳定性良好,未出现明显的絮凝或沉淀现象,包封率未有明显变化,且粒径变化不显著。第五章麦冬多糖多囊脂质体抗Ⅱ型糖尿病药理作用研究制备麦冬多糖多囊脂质体,旨在于增加麦冬多糖在体内的稳定性,并且多囊脂质体有着良好的缓释效果,能提高药物在体循环时间,提高生物利用度,进而提高药效。本章节系统性地评价了麦冬多糖(OJP-S-1)及其多囊脂质体抗Ⅱ型糖尿病的效果。OJP-MVLs组(100 mg/kg)、OJP-MVLs组(200 mg/kg)和OJPS-1组(200 mg/kg)都能显著降低Ⅱ型糖尿病小鼠的FBG水平(p0.01),改善口服糖耐量(p0.01)和胰岛素抵抗的症状(p0.01),且OJP-MVLs组(高、低剂量)效果优于OJP-S-1组(200 mg/kg)。OJP-S-1与OJP-MVLs组(高、低剂量)都能显著的降低Ⅱ型糖尿病小鼠的TC、TG和LDL(P0.01),以及不同程度的增加HDL及HDL/LDL(P0.01)。且高剂量组的OJP-MVLs改善脂代谢紊乱的效果要优于阳性药二甲双胍组。证实麦冬多糖多囊脂质体能够有效缓解血脂代谢紊乱的症状,预防心血管疾病的发生并缓解其症状。此外,OJP-S-1和OJP-MVLs高、低剂量组都能显著的增加Ⅱ型糖尿病小鼠肝葡萄糖激酶的活性(P0.01)同时减弱G-6-Pase的活性(P0.01),而且能显著的增加肝糖原含量(P0.01)。多囊脂质体的作用效果远胜于原料药,其中OJP-MVLs高剂量组改善糖代谢的效果更胜于二甲双胍组。证实麦冬多糖多囊脂质体能加速葡萄糖氧化代谢和抑制糖异生反应,并增强肝脏将血糖转化为糖原的能力。肝脏是脂代谢和糖代谢的主要器官和重要场所,因此功能良好的肝脏对Ⅱ型糖尿病的治疗也是至关重要的。肝组织的切片结果表明,麦冬多糖多囊脂质体比原料药能更好的修复因STZ诱导的Ⅱ型糖尿病而受损的肝组织,有效缓解糖尿病型肝脏病变。
【学位单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R914;R96
【部分图文】：

流程图,麦冬多糖,提取分离,流程图

麦冬多糖及其多囊脂质体抗Ⅱ型糖尿病活性研究作得到产地为湖北的麦冬粗多糖。2.1.2 三氯乙酸除蛋白将四川麦冬粗多糖和湖北麦冬粗多糖均配置成 20 %的水溶液，加入 20 %三氯乙酸溶液使体系中三氯乙酸最终浓度为 7 %，磁力搅拌 30 min，离心 30 min（10000 r/min）去除蛋白沉淀，收集上清液并用氢氧化钠溶液调 pH 至中性，减压浓缩后，装入透析袋中（截留分子量为 3500Da），在蒸馏水中透析 4 天，勤换水。合并浓缩，冻干得四川麦冬精多糖 OJP-S 和湖北麦冬精多糖 OJP-H。麦冬多糖提取分离的具体流程见图 2.1。

流程图,流程图,长扫描,全波

图 2.2 OJP-S 和 OJP-H 的纯化流程图Figure 2.2 The purification flowchart of OJP-S and OJP-H.2.3 纯度鉴定2.3.1 紫外分光光度分析将各纯化组分 OJP-S-1, OJP-H-1, OJP-H-2 配置成 1 mg/mL 的溶液，以蒸馏水为空白，在 200-800nm 范围内进行全波长扫描，检测各组分在波长 280nm 和260 nm 处是否有蛋白和核酸的吸收。OJP-S-1, OJP-H-1, OJP-H-2 在 200-800 nm 范围内的紫外全波长扫描如图2.11 所示，在 200 nm 处均显示出明显的多糖特征紫外吸收峰，三种麦冬多糖组分在 280 nm 和 260 nm 处均无明显的紫外吸收，说明其不含蛋白与核酸。2.3.2 高效液相凝胶色谱分析色谱条件：预柱为 TSK-GUARDCOLUMNPWH(7.5×75nm)，分离柱为 TSK-

洗脱曲线,柱层析,洗脱曲线,多糖

图 2.3 OJP-S 的 D101 柱层析洗脱曲线Figure 2.3 The D101 column chromatography elution curve of OJP-S.图 2.4 OJP-S 的高效液相凝胶色谱图Figure 2.4 High-performance gel filtration chromatography (HPGFC) profile of OJP-S.为验证这一点将这四个组分合并为 OJP-S-1，旋蒸，过 DEAE-52 柱层析，结果如图 2.5 所示，结果只有水洗脱部位 (1-50 管) 含有多糖成分，各个浓度的NaCl 洗脱液几乎不含多糖，说明四川麦冬精多糖中只有中性多糖，将水洗部分浓缩进样，得到的色谱图 2.6 依然是相对均一的组分，所以推测四川麦冬精多糖中只含有一种均一多糖组分即 OJP-S-1。

【参考文献】