构建荧光报告分子用于OGT抑制剂的高通量筛选

发布时间：2020-09-07 13:56

　　 O-GlcNAc修饰是一种细胞内广泛存在的翻译后修饰,对细胞的许多生理机制都有重要的调节作用,异常的O-GlcNAc修饰与多种癌症的发生发展及其它人类重大疾病存在着密切关系。目前常用的O-GlcNAc修饰的检测方法是依赖抗体进行的免疫组化染色或western-blot检测,虽然准确,但步骤繁琐,不适用于大批样品的检测以及抑制剂的筛选。此外,有人在代谢标记法的基础上引入FRET(荧光共振能量转移)技术,能够进行O-GlcNAc修饰的成像与检测,但是此类方法中有的只能进行细胞外检测,有的需要引入特殊化合物容易引起细胞毒性,适用性不高。所以需要一种方法,能够方便准确地检测O-GlcNAc修饰并且还可进行相关抑制剂的高通量筛选。我们以转录调控为作用原理,构建了一个荧光报告分子可以在细胞保持生理活性的状态下进行O-GlcNAc修饰水平的检测。该报告分子主要包括三个组分,一个是功能上受O-GlcNAc修饰影响的转录因子NeuroD1,另一个是胰岛素启动子(IP)驱动表达的增强型绿色荧光蛋白(eGFP)作为报告基因(IG),其中IP受NeuroD1的调控,第三个组分是由CMV启动子驱动表达的红色荧光蛋白(RFP)作为内参基因(CR)。报告基因和内参基因之间插入转录终止信号和翻译终止密码子,使两者相互独立。将NeuroD1通过P2A(一段自我剪切肽链)连在RFP下游,使NeuroD1和RFP共用一个CMV启动子,但利用P2A将两个蛋白彼此分开,各自发挥功能。我们验证了荧光报告分子(IGCRN)的功能,可以准确检测细胞内O-GlcNAc修饰水平下调的情况,还可以响应不同浓度的OGT抑制剂OSMI-1和HBP通路的抑制剂DON。同时,我们还用IGCRN检测了OSMI-1和DON的EC50,分别是5.93μM和33.08μM。我们希望可以利用IGCRN稳定表达的细胞系,进行OGT和HBP通路抑制剂的高通量筛选。
【学位单位】：南开大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R91
【部分图文】：

O-GlcNAc修饰（Hongiketal,2018）

HBP通路（Yangetal,2015）

第一章 前言初发现于口蹄疫病毒（FMDV）当中，位于小核糖核酸病毒两种蛋白质之间。后来又在许多不同类型的病毒中发现了其 2A 序列，包括 P2A（porcine teschovirus-1 2A），T2A（Thosea （equine rhinitis A virus 2A），BmCPV 2A（cytoplasmic polyhe BmIFV 2A（flacherie virus 2A）。2A 具有一段高度保守X)NPGP-，其中 X 代表任意一种氨基酸。其切割位点位于这酸（G）和脯氨酸（P）之间，自我切割后，切割位点的 N 端蛋白质相连接，而最后一个果仁糖残基则保留在原来的下游的 2A 残基可以通过弗林蛋白酶去除。自我剪切机制见下图

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本文编号：2813430