PEG化HIV-1融合抑制剂的耐药性和作用机制研究

发布时间：2020-09-07 19:12

　　研究目的与意义艾滋病是由人类免疫缺陷病毒引起的一种慢性传染病,目前尚未研制成功有效的艾滋病疫苗,抗HIV-1药物仍然是治疗艾滋病的主要手段。传统的抗HIV-1药物主要是针对病毒逆转录酶、蛋白酶或整合酶的小分子抑制剂,其发挥作用的靶点是病毒进入细胞后的阶段。随着HIV-1入侵宿主细胞分子机制的逐步阐明,阻止病毒进入细胞的HIV-1融合抑制剂逐渐成为艾滋病药物的研究热点。恩夫韦肽作为目前唯一被美国FDA批准的HIV-1融合抑制剂,因体内半衰期短和注射频繁等缺点严重制约了其临床应用。长效化HIV-1融合抑制剂具有更好的药代动力学特性,不仅可以降低药物的使用频率,减轻患者的痛苦和经济负担,还可以用于预防高危人群HIV-1的感染。但随着抗病毒治疗药物的广泛应用,HIV-1在药物选择压力下发生突变,导致耐药性的产生,致使病毒对药物敏感性下降或不敏感。聚乙二醇(PEG)修饰通过改善多肽药代动力学,从而延长药物半衰期,目前许多PEG化的多肽药物已用于临床。本课题与中科院微生物所合作合成了PEG化C34,以发现阻止HIV-1进入细胞的新一代长效化HIV-1融合抑制剂为最终目的,针对PEG化HIV-1融合抑制剂的耐药性这一科学问题,在全面分析其对我国HIV-1临床分离病毒株药物敏感性基础上,深入探讨PEG化HIV-1融合抑制剂的耐药突变位点及其引发耐药的机制,以期为今后药物设计提供新的思路。研究方法1.HIV-1病毒株的复制和制备采集自四川、广西、北京和安徽的47株中国主要流行亚型HIV-1临床分离株,两段法扩增HIV-1临床分离病毒株近全长基因序列,序列拼接、处理后构建进化树分析其亚型;分离外周血单个核细胞(PBMCs)用于47株临床分离病毒株的复制;pNL4-3转染HEK293T细胞获得实验室适应株NL4-3;在TZM-bl细胞上测定复制或转染所得病毒的半数组织细胞感染量(TCID50)和p24含量。2.基于TZM-bl细胞的HIV-1融合抑制剂的体外抑制实验与中科院微生物所合作完成了 PEG化HIV-1融合抑制剂的合成和制备。将T20、C34和PEG修饰的C34(PEG2kC34和PEG5kC34)倍比稀释后分别与HIV-1包膜蛋白、实验室适应株NL4-3以及47株中国主要流行亚型HIV-1临床分离株在TZM-bl细胞上共培养48 h,通过检测TZM-bl细胞相对荧光单位值计算PEG化C34对HIV-1包膜蛋白介导的细胞-细胞融合和HIV-1复制的抑制能力。3.PEG修饰前后C34对HIV-1 gp41六螺旋结构形成抑制实验通过圆二色谱检测PEG修饰前后C34与靶序列(N36)在195 nm到270 nm波长范围内以及在222 nm处从20℃到98℃温度范围内的摩尔椭圆率变化,通过计算α-螺旋的百分比和Tm值来确定两者之间的结合能力。将终浓度为100 μM的C34或PEG化C34与不同稀释度的N36在37℃孵育30 min,通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳测定多肽与N36形成六螺旋结构的能力。4.大鼠体内PEG化C34半衰期测定选取12只7周龄SD大鼠,随机分为3组。单次皮下注射PEG修饰前后C34,在注射前和注射后不同时间点从尾静脉采血,将倍比稀释的血浆与NL4-3病毒于TZM-bl细胞上共培养48 h,通过检测荧光表达情况,计算PEG修饰前后C34抑制50%病毒感染的血浆稀释度。5.PEG化HIV-1融合抑制剂的体外药物压力实验和耐药位点的鉴定MT2细胞每3至4天传代,通过观察合胞体的形成情况监测病毒复制。在每个病毒突破点,抑制剂的浓度加倍。运用巢式聚合酶链反应扩增不同多肽浓度下病毒gp41序列,通过比对获得病毒逃逸突变位点。以质粒pNL4-3为骨架,利用分子克隆技术和定点突变试剂盒,构建包含突变位点的质粒,将测序鉴定正确质粒转染HEK293T细胞,测定病毒滴度和p24含量。通过病毒表型耐药实验,比较病毒突变前后对PEG化C34和T20的药物敏感性,确定耐药位点。6..深度测序检测体外HIV-1融合抑制剂压力下病毒的耐药位点收集体外药物压力下病毒培养上清,提取第8、9和10代病毒培养上清RNA,一步法巢式PCR扩增HIV-1 gp41基因,纯化回收后送北京地坛医院传染病研究所完成测序。7..病毒适应性测定将含有PEG化C34耐药位点的病毒与野生毒株按1:11比例混合后定量感染PM1细胞,于感染的第3天至第6天收集半量培养液和细胞,用抗-Thy1.1和抗-Thy1.2抗体染色,经流式细胞仪检测感染细胞百分比,确定毒株的相对复制适应性。研究结果1.PEG化HIV-1融合抑制剂能够有效抑制我国主要流行亚型HIV-1临床分离病毒株的复制,呈现较好的广谱性。成功合成了两种PEG化HIV-1融合抑制剂,质谱分析其平均分子量分别为6,500 Da和9,300 Da,液相色谱分析其纯度均大于98%。敏感性实验表明PEG化HIV-1融合抑制剂可以有效抑制HIV-1包膜蛋白介导的细胞-细胞融合和实验室适应株NL4-3的复制,对我国主要流行亚型HIV-1临床分离病毒株特别是占比最高的CRF01 AE亚型毒株具有较好的抑制活性,PEG2kC34和PEG5kC34的EC50平均值分别为19.34 nM和19.64 nM;该类PEG化HIV-1融合抑制剂体外细胞毒性较低,其CC50均大于100μM。2.PEG化C34通过与NHR结合形成稳定的六螺旋结构抑制病毒包膜蛋白与细胞膜融合并呈现较长的半衰期圆二色谱结果显示两种PEG化C34均可与HIV-1 gp41相应序列结合,形成高α-螺旋复合物,PEG2kC34与N36形成93.90%α-螺旋,PEG5kC34与N36形成96.58%α-螺旋;复合物N36/PEG2kC34和N36/PEG5kC34的熔解温度分别为57.03 ℃和55.04 ℃。非变性凝胶电泳结果显示,与C34相似,PEG修饰后的C34同样可以与N36结合形成稳定的六螺旋结构,并且在一定范围内这种结合与N36具有剂量依赖关系。此外,PEG修饰使C34在SD大鼠体内半衰期显著延长。3.L44V和N126K位点同时出现增强了病毒对PEG化C34的耐药性压力实验中多肽C34、PEG2kC34和PEG5kC34的最终浓度分别为其起始浓度的4.096倍、1,024倍和512倍。经过7个月筛选,获得三株HIV-1耐药株。其突变发生在gp41的第44、126和250位氨基酸。在C34压力下,第9代开始出现之前未报道的L44V突变位点,N126K突变位点则在更早期的第5代开始出现;在PEG2kC34压力下,L44V和N126K突变同时在第4代出现;在PEG5kC34压力下,本实验中未检测L44V或者N126K突变位点,但在第7代检测到R250Q突变位点。L44V或N126K突变可导致PEG2kC34和PEG5kC34的药物敏感性降低4.2倍和2.3倍或1.2倍和1.6倍,而L44V和N126K双位点突变后病毒的药物敏感性降低了 12.4倍或9.8倍。10E8抗体对含突变位点病毒株的中和实验结果表明,耐药位点对gp41结构产生了一定的影响。因此,我们推测PEG化C34的耐药性需要L44V和N126K共同维持。4.L33S和R271K位点同时出现增强了PEG化T20的耐药性Gp41区只出现L33S突变位点时,T20、PEG2kT20和PEG5kT20的EC50均有较大改变,但改变程度存在差异,其EC50分别变为原来的12倍、83倍以上和28倍;Gp120区只出现R271K突变位点时,抑制剂的EC50变化较小,且抑制剂间差异也较小,分别变为原来的1～3倍;L33S和R271K同时突变时抑制剂的EC50表现出较之前两位点单独突变时更大的差异,抑制剂的EC50均变为原来的83倍以上,即gp120区的R271K能够增强L33S的耐药性,之前我们未见相关报道。T20耐药株对PEG修饰T20的交叉耐药实验结果显示,T20耐药性与PEG2kT20或PEG5kT20存在差异,其中NL4-3-V38A、NL4-3-V38E-N42S、NL4-3-V38A-N42D和NL4-3-V38A-N42T对T20、PEG2kT20和PEG5kT20均表现出了不同程度的耐药;而NL4-3-N43K对T20和PEG5kT20表现出一定程度的耐药但本课题中未观察到其对PEG2kT20的耐药现象。HIV-1 gp41基因深度测序,检测到多个组内单核苷酸多态性位点,并且PEG化C34和T20的耐药性存在差异。5.N126K突变位点显著降低病毒的相对复制适应性流式细胞仪检测AT1和含耐药位点AT2病毒株的相对复制适应性。实验结果显示,L44V、N126K和R250Q均可以在不同程度上降低病毒的相对复制适应性,其中N126K突变可显著影响病毒的相对复制适应性,但该显著性在溶液中存在C34的情况下消失。结论PEG化HIV-1融合抑制剂可以有效抑制HIV-1 env介导的细胞-细胞融合和实验室适应株NL4-3的复制,对我国主要流行亚型HIV-1临床分离病毒株也具有较好的抑制广谱性,在SD大鼠体内的半衰期显著延长。N126K和L44V位点同时出现能够增强PEG化C34耐药性,N126K突变位点能够显著降低病毒的相对复制适应性;与PEG化C34不同,PEG化T20的主要耐药位点是L33S,L33S和R271K同时出现能增强其耐药性。本研究为长效化HIV-1融合抑制剂的耐药性及作用机制研究提供了一定的理论基础。
【学位单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R96
【部分图文】：

功能图,蛋白结构,功能,结构蛋白

Ｐｏｌ结构蛋白可以编码蛋白酶、逆转录酶、ＲＮＡ酶Ｈ和整合酶；Ｅｎｖ结构蛋白在逡逑内质网上可以被酶切为ｇｐｌ２０和ｇｐ４１［ｌｌ］，ｇｐｌ２０可以介导病毒辅助受体与ＣＤ４逡逑的结合，而ｇｐ４１主要参与融合过程（图２）。逡逑ＬＴＰ逦ｖｌｆ逦ｖｐｕ逦ｉ邋ａｎｖ逦ｎｅｆ逡逑Ｋ东螓》＊／ｔＷ逦ｍr>感染Ｉｔ因７，ｐ２３＞逦？？？白Ｕ逦白逦负＊控子＜ｐ２心逡逑＊＞包含ａ合？主？呆因逦＊X/雇＊主因Ｔ的抑逦0邋ｔｔ进ＣＤｉＷ邋0在内庙Ｈ上《＿Ｗ）为邋＊促《萑主坩Ｗ＊面的逡逑子的ｗａｔ＊？产生史多挖＊逦ｗ．邋ｋｗ病＊邋ｇｐ丨川扣00ｊｉ逦ｃｄ４及ｍｈｃ丨表达下？逡逑？邋Ｗ录ｔｅ？所＊＊逦的ＲＴ＊合夢逦《？粒的释放逦？邋ａｐ丨２（）介异供寓与ＣＤ丨＊甩止＊亡逡逑？笆含结合邋Ｔａｌ邋的邋ＲＮＡ邋反逦《？！？？？！邋枝的从▲邋？？？？！＊＊”＊？？逡逑式S不钣Υ鹪妫翦澹簦幔颍危徨危扛腨曲物澈活的状？逡逑－９Ｐ４Ｉ介！＾合逦？《少Ｎｅ枈发播逋度逡逑？邋ｆ９＾Ｓ８＊Ｒｅｖ？ＲＮＡ逡逑，ａ＊７ｔ？邋－ＲＲ６．邋Ｌ逡逑５－ｒ0３Ｂｕ５Ｍｆｉ＾＊ａａ６逦■逦｜－＊Ｕ３Ｑｕ５｜邋３．逡逑逦逦Ｉ逦｜逦—逦■邋Ｔ邋－逦＿逡逑ｇａｇ逦ｐｏｌ逦ｖｐｒ逦ｒｅｖ逦ｔａｔ逡逑Ｐ５５蠹白逦多《＿逦供榛隹白Ｒ邋ｆｐｌ５＞逦Qy蹦洁锕锏骺刈渝遄蛹せ钭印穑欤矗义希慷啵保茫祝畆罃傆桑澹垮澹款锒嗌耩昵菽疱澹僦担眄駉w？衣《逦＾ｐｌ＊？？逦＊结合ＴＡＲ逡逑Ｓ白由《９切？４神小ｆｉ白逦？包《？白拍《＿的＃担财?逦》？含ＲＱＥ逦■与有生细胙的阁明逡逑■邋ＭＡ＃？＊邋白邋‘ｐｌ７

比例分布,亚型,蛋白

ＣＨＩＮｉ＾逡逑图１中国ＨＩＶ－１流行亚型比例分布逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１邋Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ａｌｌ邋ＨＩＶ－１邋ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：邋ＣＨＩＮＡ逡逑特征逡逑－１颗粒呈球形，直径约１２０邋ｍｎ［９ｊ，有包膜。其基因组长９．２－９．８邋ｋｂ，两端为长末端重复序列（Ｌｏｎｇｔｅｒｍｉｎａｌ邋ｒｅ的编码基因，排列紧凑，部分区域重叠，编码结构蛋白ｔａｔ和ｒｅｖ及附属蛋白ｎｅｆ、ｖｐｒ、ｖｉｆ和ｖｐｕ［１Ｇ］。其中蛋白（ｐｌ７）、ＣＡ衣壳蛋白（ｐ２４）、ＮＣ核衣克蛋白（以编码蛋白酶、逆转录酶、ＲＮＡ酶Ｈ和整合酶；Ｅｎｖ酶切为ｇｐｌ２０和ｇｐ４１［ｌｌ］，ｇｐｌ２０可以介导病毒辅助１主要参与融合过程（图２）。逡逑

核苷酸序列,复制周期,抗病毒药物

ＤＮＡ形式后整合到宿主细胞ＤＮＡ中；经转录和翻译过程表达病毒蛋白成分，经组装形成新的病毒粒子并释放出细胞［１２］。ＨＩＶ－１的高突变与频致其核苷酸序列呈多样性，增加了疫苗研制的困难，目前治疗ＨＩＶ－１的是研发安全高效的抗ＨＩＶ－１药物。作用于ＨＩＶ－１复制周期不同阶段药物包括ＨＩＶ－丨融合抑制剂、辅助受体抑制剂、逆转录酶抑制剂（核苷酶抑制剂和非核苷类逆转录酶抑制剂）、蛋白酶抑制剂和整合酶抑制剂（至２０１８年４月１２日，美国ＦＤＡ批准的抗ＨＩＶ药物共４０种，包括１３逆转录酶抑制剂、６种非核苷类逆转录酶抑制剂、１１种蛋白酶抑制剂、合酶抑制剂、１种融合抑制剂、１种辅助受体抑制剂和５种组合药ｓ：／／ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ＦｏｒＰａｔｉｅｎｔｓ／Ｉｌｌｎｅｓｓ／ＨＩＶＡＩＤＳ／Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ／ｕｃｍ邋１１８９１５．ｈｔｍ）。研发的不断深入，作用于新的靶点或具有新的作用机制的药物将不断被Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ逡逑

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