STAT3负调控PTEN介导β细胞凋亡影响高血糖的作用及分子机制研究

发布时间：2020-09-08 13:23

　　研究目的:胰岛β细胞死亡是1型糖尿病的主要原因,也是2型糖尿病β细胞减少的关键因素。1型和2型糖尿病的特征是胰岛素分泌受损和高血糖。虽然可以通过药物控制高血糖,但这些药物都无法靶向内源性β细胞阻止疾病进展。目前,维持内源性胰岛β细胞数量及功能是调控高血糖的研究热点之一,但其分子机制仍未完全阐明。因此,深入研究β细胞凋亡的分子机制,并从中发现可干预的靶点,有望为临床血糖调控提供指导并推动新型靶向抗高血糖药物的研发。信号转导与转录激活因子3(Signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)与细胞存活、增殖、分化和凋亡密切相关,影响机体各项生命活动。STAT3研究主要集中在免疫调控和肿瘤恶性进展,但与代谢相关疾病的关系同样备受关注。肝细胞、下丘脑神经元、脂肪组织T淋巴细胞和骨骼肌细胞中的STAT3作为关键调控因子,影响糖代谢及胰岛素信号通路。因此,STAT3很可能与β细胞凋亡密切相关,其关系有待阐明。本课题主要研究STAT3通过PTEN调控β细胞凋亡影响高血糖进程的分子调控机制,以及靶向PTEN治疗高血糖的作用研究。第一部分STAT3在β细胞损伤中的作用研究研究方法:本研究分别采用大鼠胰岛细胞瘤细胞株INS-1细胞、小鼠原代胰岛细胞、STZ诱导的高血糖小鼠模型和HFD诱导的肥胖小鼠模型评价STAT3在β细胞损伤中的作用。(1)采用Western blotting和Immunohistochemistry法考察不同β细胞损伤模型中STAT3的活性变化;(2)构建β细胞中STAT3特异性敲除小鼠;(3)OGTT和ITT法考察STZ/HFD诱导对β-STAT3KO小鼠β细胞功能的影响;(4)Immunofluorescence 和 Immunohistochemistry法考察不同模型β-STAT3KO小鼠胰岛结构和β细胞功能;(5)通过siRNA技术干扰STAT3的表达,通过Western blotting和Immunofluorescence检测INS-1细胞凋亡和增殖;(6)通过Western blotting和Immunofluorescence检测同窝野生型和β-STAT3KO小鼠β细胞凋亡和增殖;(7)荧光定量PCR技术检测β细胞相关转录因子变化;(8)采用流式细胞术和HE染色考察炎性细胞浸润情况。研究结果:(1)β细胞损伤对STAT3活性的影响给予不同化合物(葡萄糖、STZ和H202)刺激INS-1细胞,结果显示细胞损伤影响STAT3激活,且损伤程度与pSTAT3表达呈负相关;STZ大剂量单次诱导C57BL/6J雄鼠形成高血糖,结果显示高血糖进展与β细胞中pSTAT3表达呈负相关;高脂饲料喂养C57BL/6J雄鼠16周,小鼠胰岛中STAT3和pSTAT3均无明显变化。(2)STAT3特异性敲除对高脂饲料诱导的肥胖小鼠的影响β-STAT3KO小鼠成功构建,并且存在肥胖表型;高脂饲料喂养16周后,野生型小鼠与β-STAT3KO小鼠血糖略有升高,糖耐量曲线轻微上移,β细胞均发生代偿性增殖,胰岛结构正常,但两组小鼠间无明显差异。(3)STAT3特异性敲除对STZ诱导的高血糖小鼠的影响β-STAT3KO小鼠对STZ 40mg/kg连续3天造模更敏感,易形成高血糖,而β-STAT3KO小鼠STZ 150 mg/kg单次造模后与野生型小鼠几乎无差异,均表现为高血糖;与同窝野生型小鼠相比,STZ诱导的β-STAT3KO小鼠表现为体重减轻,口服糖耐受不良,胰岛素分泌减少,β细胞质量和比例降低,胰岛萎缩且结构紊乱;野生型小鼠STZ 40mg/kg连续3天造模血糖无明显变化,而连续5天造模血糖迅速升高,β细胞胰岛素分泌减少,胰岛结构明显破坏,β细胞比例下降且未发生代偿性增殖;INS-1细胞沉默STAT3,与不同浓度STZ共孵育,STAT3敲低明显促进细胞凋亡,抑制细胞增殖,STZ诱导的β-STAT3KO小鼠β细胞凋亡明显增加,β细胞增殖与转录因子活性均受到抑制,而免疫细胞未参与该过程。第二部分STAT3通过PTEN-AKT调控β细胞凋亡的信号通路和分子机制研究方法:本研究分别采用大鼠胰岛细胞瘤细胞株INS-1细胞、小鼠原代胰岛细胞、人胚胎肾细胞293FT和STZ诱导的高血糖小鼠模型考察STAT3-PTEN信号通路调控β细胞凋亡的作用机制。(1)采用qRT-PCR法考察STZ诱导的野生型和β-STAT3KO小鼠原代胰岛中糖代谢相关信号通路、胰岛素信号通路和糖尿病相关基因变化;(2)通过ELISA和qRT-PCR方法检测MyD88信号通路相关炎性因子变化;(3)通过siRNA技术干扰INS-1细胞STAT3表达,采用qRT-PCR和Western blotting检测PTEN的表达情况;(4)通过Western blotting和Immunofluorescence检测β-STAT3KO小鼠胰岛中PTEN表达情况;(5)构建β细胞中STAT3-PTEN特异性敲除小鼠;(6)检测STZ诱导后β-STAT3-PTENDKO、β-STAT3KO和野生型小鼠血糖及口服糖耐量变化;(7)通过 Immunofluorescence 法检测 STZ 诱导后 β-STAT3KO、β-STAT3-PTENDKO和野生型小鼠胰岛结构及细胞凋亡情况;(8)采用Luciferase法检测PTEN调控β细胞相关转录因子转录活性;(9)通过qRT-PCR和Immunofluorescence考察β细胞相关转录因子基因和蛋白层面表达情况;(10)采用Western blotting和Immunohistochemistry法考察STAT3-PTEN下游蛋白变化情况;(11)通过AKT抑制剂考察STZ诱导后不同基因型小鼠血糖及口服糖耐量变化;(12)Western blotting和qRT-PCR检测凋亡相关蛋白及β细胞相关转录因子表达情况。研究结果:(1)STAT3调控β细胞存活和功能的下游关键因子寻找小鼠胰岛qRT-PCR结果显示Myd88和Pten mRNA在β-STAT3KO小鼠胰岛中表达明显增加;β-STAT3KO小鼠胰岛中MyD88相关促炎因子和趋化因子蛋白分泌和基因转录均无变化,并且在INS-1细胞中分别或共沉默STAT3、MyD88对细胞凋亡无影响;敲低STAT3,INS-细胞中PTEN的转录和翻译水平均增加,并且在β-STAT3KO小鼠胰岛中PTEN发生明显累积,经STZ诱导累积进一步加剧。(2)STAT3-PTEN特异性敲除对STZ诱导的高血糖小鼠的影响β-STAT3-PTENDKO小鼠成功构建;β细胞中STAT3-PTEN双敲除逆转STZ诱导的β-STAT3KO小鼠高血糖进程,并且改善口服糖耐受不良,保护胰岛结构和功能,抑制β细胞凋亡。(3)STAT3-PTEN信号通路通过调控AKT影响β细胞存活和功能我们通过luciferase实验发现沉默STAT3明显抑制PDX1和MAFA基因转录活性,而进一步抑制PTEN能逆转该现象;STAT3-PTEN特异性敲除有效逆转高血糖β-STAT3KO小鼠相关转录因子活性,减少β细胞凋亡,增加PDX1+β细胞比例,并且促进PDX1、Nkx6.1和pAKT蛋白表达;AKT抑制剂AZD5363能阻断STAT3-PTEN信号通路,诱导小鼠血糖升高,口服糖耐量发生变化,β细胞凋亡和相关转录因子抑制,其中对β-STAT3KO小鼠影响程度最大。第三部分PTEN抑制剂bpv(phen)对STAT3突变高血糖的治疗作用研究方法:本研究分别采用STZ大剂量单次、STZ小剂量3次和5次的动物模型评价PTEN抑制剂bpv(phen)对高血糖的治疗作用,并且使用AKT抑制剂AZD5363探索bpv(phen)参与调控β细胞功能的作用机制。(1)使用PTEN抑制剂bpv(phen)考察其对大剂量单次或小剂量5次STZ诱导的小鼠高血糖进程的影响;(2)使用PTEN抑制剂bpv(phen)考察对STZ诱导的β-STAT3KO小鼠体重及血糖的影响;(3)OGTT和ITT法考察bpv(phen)对STZ诱导的β-STAT3KO小鼠β细胞功能的影响;(4)采用Immunofluorescence和Immunohistochemistry法考察β细胞质量及胰岛结构变化;(5)Western blotting和Immunostaining检测bpv(phen)对β细胞存活和增殖相关基因的影响;(6)使用AKT抑制剂AZD5363考察对bpv(phen)作用下的STZ诱导的β-STAT3KO和野生型小鼠血糖和口服糖耐量影响;(7)通过Western blotting 比较 STZ诱导的β-STAT3-PTENDKO小鼠单用AZD5363和STZ诱导的β-STAT3KO小鼠合用bpv(phen)和AZD5363 两者差异;(8)通过Immunofluorescence检测bpv(phen)单用或与AZD5363合用下游信号通路变化。研究结果:(1)PTEN抑制剂对普通高血糖小鼠的治疗作用实验采用了 STZ 150 mg/kg大剂量单次和STZ 40 mg/kg小剂量连续5次两种经典的诱导高血糖的方法,分别对野生型小鼠进行诱导后连续给予bpv(phen)直到实验终点,均无降低血糖作用。(2)PTEN抑制剂对STAT3特异性缺失小鼠高血糖的治疗作用实验采用了STZ 40 mg/kg小剂量连续3次对β-STAT3KO和同窝野生型小鼠进行诱导后给予bpv(phen),发现能有效逆转β-STAT3KO小鼠高血糖并维持正常体重,同时改善β-STAT3KO小鼠口服糖耐受不良,促进STZ诱导的β-STAT3KO小鼠β细胞分泌足够的胰岛素调控血糖平衡,维持小鼠β细胞质量,保护小鼠胰岛结构,抑制β细胞凋亡,促进β细胞增殖以及激活β细胞相关转录因子。(3)bpv(phen)调控AKT信号通路影响STZ诱导的β-STAT3KO小鼠高血糖进程我们将STZ小剂量连续3天造模后的野生型和β-STAT3KO小鼠各自分成两组,进行bpv(phen)单用或与AZD5363合用,合用组β-STAT3KO小鼠血糖不断上升,成功拮抗bpv(phen)单用的治疗作用,并破坏了单用改善的β-STAT3KO小鼠口服糖耐量,合用组β-STAT3KO小鼠胰岛萎缩且β细胞凋亡率明显增加。研究结论:本研究在体内外模型中均证实STAT3在β细胞损伤后活性受到明显抑制。构建β细胞中STAT3敲除小鼠((β-STAT3KO),发现其对小剂量多次STZ刺激更敏感,表现为血糖明显升高,胰岛β细胞凋亡。结果显示,STAT3缺失条件下PTEN在β细胞中明显累积,PTEN通过抑制AKT磷酸化,抑制β细胞相关转录因子活性,促进凋亡信号通路介导β细胞凋亡。进一步敲除β细胞中PTEN或使用PTEN抑制剂bpv(phen)能有效逆转STZ诱导的β-STAT3KO小鼠高血糖进程,维持β细胞功能和存活。通过本课题的研究,不仅将揭示STAT3调控胰岛β细胞影响高血糖进展的重要作用,还将揭示STAT3调控下PTEN介导的胰岛β细胞凋亡全新分子机制,并挖掘PTEN作为特异性靶点,治疗STAT3功能缺失性高血糖的作用,推动精准医疗发展。
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R96

【相似文献】