PHII-7体外抑制肿瘤侵袭迁移作用机制研究

发布时间：2020-09-11 09:53

　　背景：肿瘤侵袭迁移是恶性肿瘤的主要特征之一,也是导致肿瘤治疗失败、肿瘤复发和病人死亡的主要原因之一,但是目前针对肿瘤侵袭迁移仍无有效的治疗方法。中药当归龙荟丸用于治疗慢性粒细胞性白血病有较好的疗效,其活性成分靛玉红有显著的抗肿瘤活性。本室以靛玉红的分子结构为模板,设计、合成并筛选出一种有较高抗肿瘤活性、较低毒性的衍生物,将其命名为PHII-7。实验室前期研究发现,PHII-7呈现良好的广谱抗肿瘤活性,对人慢性粒细胞白血病细胞株k562和k562/A02(k562多药耐药细胞株),人急性早幼粒细胞株HL60和HL60/ADR (HL60多药耐药细胞株),人乳腺癌细胞株MCF-7和MCF-7/ADR (MCF-7多药耐药细胞株)等有明显细胞生长抑制作用。本文主要探究PHII-7体外对肿瘤细胞侵袭迁移的作用及其作用机制。方法：本文以3株高侵袭迁移细胞株MDA-MB-231(人乳腺癌细胞株),MCF-7/ADR(人乳腺癌MCF-7多药耐药细胞株)和A549(人肺腺癌细胞株)作为研究对象,对PHII-7体外抑制肿瘤细胞侵袭迁移作用及作用机制进行研究。实验方法如下：通过MTT法对肿瘤细胞增殖进行检测；通过细胞计数法检测细胞生长速率；通过细胞集落形成实验测定细胞克隆形成能力和增殖能力；通过transwell实验和划痕实验检测细胞侵袭迁移能力；通过流式细胞仪检测细胞凋亡和坏死情况；通过realtimePCR实验检测基因mRNA水平表达；通过免疫印迹实验(western blot)检测基因蛋白水平表达。实验结果为3次重复实验结果,用SPSS13.0软件和Graphpad软件进行数据分析。结果：首先,实验发现MCF-7/ADR细胞与MCF-7细胞相比有较强的侵袭性和迁移性,其上皮-间质转化现象(EMT)特征明显,EMT标记物E-cadherin表达明显降低,而Slug, β-catenin和vimentin表达明显增强。其次,PHII-7在低浓度条件下能有效地抑制肿瘤细胞侵袭和迁移,且呈明显的浓度依赖性。PHII-7在高浓度条件下能有效地抑制细胞增殖和集落形成,对细胞生长抑制呈浓度依赖性和时间依赖性。PHII-7能诱导高侵袭迁移性细胞凋亡,主要是通过激活凋亡相关经典信号通路caspase家族实现。进一步研究发现,PHII-7抑制侵袭迁移作用机制与EMT过程有关,PHII-7作用侵袭迁移性肿瘤细胞能有效增强其上皮细胞相关基因表达,降低间质细胞相关基因表达,其中包括EMT标记基因E-cadherin, Slug, β-catenin和vimentin,表明PHII-7抑制肿瘤细胞侵袭迁移主要通过调控EMT相关基因表达实现。结论：药物治疗一直是临床常用的肿瘤治疗手段,但其毒副作用较大。目前急需加快抗肿瘤药物研发,完善临床治疗策略。PHII-7是一种有研究价值的抗肿瘤衍生物,PHII-7不仅能增强耐药肿瘤细胞对药物的敏感性,抑制肿瘤细胞侵袭迁移,体内外对肿瘤细胞生长也有显著的抑制作用。对PHII-7抗肿瘤作用机制的研究为研发低毒高效的抗肿瘤药物、临床辅助治疗药物和分子靶向药物提供重要数据。背景：近年来抗肿瘤药物发展迅速,尤其是针对有效靶点的抗肿瘤药物。PHII-7是以传统中药当归龙荟丸的活性成分靛玉红为模板设计、合成的抗肿瘤衍生物。PHII-7体外有良好的广谱抗肿瘤活性,能明显抑制多种肿瘤细胞和耐药细胞生长,但PHII-7具体作用机制仍不明确。实验室前期对PHII-7的抗肿瘤作用机制进行了初步研究,利用化学修饰和蛋白组学方法研究发现,PHII-7氨烷基侧链衍生物体外可以与k562细胞裂解物中的α-烯醇化酶(ENO1)结合。为进一步探究PHII-7与其特异性结合的靶蛋白ENO1的关系,前期构建和筛选了稳定干扰ENO1的k562细胞系k562-shENO1及其对照细胞系k562-shC()N,本文对稳定干扰ENO1细胞株进行了鉴定,旨在探究PHII-7作用机制及干扰ENO1后对PHII-7作用的影响。方法：本文以2株稳定干扰细胞株k562-shCON和k562-shENO1作为研究对象,对PHII-7体外作用机制进行研究。实验方法如下：通过倒置显微镜观察细胞形态；通过MTT法对肿瘤细胞增殖进行检测；通过细胞计数法检测细胞生长曲线；通过流式细胞仪检测细胞凋亡和坏死情况；通过甲基纤维素半固体集落形成实验检测细胞克隆形成能力；通过流式细胞仪检测细胞群中干细胞比例；通过realtimePCR实验检测基因mRNA水平表达；通过免疫印迹实验(western blot)检测基因蛋白水平表达；通过动物体内肿瘤形成实验检测细胞生长和干性。实验结果为3次重复实验结果,用SPSS13.0软件和Graphpad软件进行数据分析。结果：稳定干扰细胞株k562-shCON和k562-shENO1与k562细胞相比,形态无明显改变,细胞生长为正常悬浮状态。实验发现稳定干扰ENO1后,k562细胞对PHII-7抑制细胞增殖作用更为敏感。通过细胞计数法检测发现稳定干扰细胞株k562-shCON和k562-shENO1生长速率无明显差异,但k562-shENO1对低浓度PHII-7抑制生长作用更敏感。PHII-7能诱导k562-shCON细胞和k562-shENO1细胞凋亡,主要通过激活凋亡相关经典信号途径caspase家族实现。共聚焦显微镜观察发现PHII-7能诱导k562-shCON细胞核和k562-shENO1细胞核裂解,且k562-shENO1细胞核裂解更明显。动物体内肿瘤形成实验发现,k562-shCON实验组裸鼠肿瘤全部形成,且瘤体积较大；k562-shENO1实验组裸鼠肿瘤形成比例较小,且瘤体积较小。结论：通过化学修饰和蛋白质组学研究方法发现,PHII-7体外能与ENO1结合。通过进一步体外细胞学实验发现,在k562细胞内干扰ENO1表达,能显著增强PHII-7对细胞的杀伤作用,表明PHII-7在细胞内的作用可能首先是通过抑制或影响ENO1功能实现,但PHII-7作用机制和作用靶点还需进一步研究。对PHII-7作用机制和作用靶点的研究,将为新型抗肿瘤药物设计和研发提供重要的数据,并有利于对传统抗肿瘤药物当归龙荟丸的进一步研究和临床应用。背景：药物治疗是临床肿瘤治疗常用方法之一,目前部分抗肿瘤药物会产生耐药现象,如乳腺癌常用抗肿瘤药物他莫昔芬。肿瘤耐药的产生是肿瘤治疗失败的主要原因之一,也是肿瘤临床治疗的难题。研究表明,α烯醇化酶(ENO1)与肿瘤细胞耐药产生和发展密切相关,耐药肿瘤细胞中ENO1常呈异常表达状态。本实验旨在研究ENO1在人慢性粒细胞白血病多药耐药细胞株k562/A02中的作用。方法：通过稳定转染,将pSilencer U6-shCON质粒和pSilencer U6-shEN01质粒转入k562/A02细胞中,利用筛选标记潮霉素进行筛选和单克隆细胞培养,构建稳定干扰ENO1的k562/A02-shENO1细胞株和对照k562/A02-shCON细胞株；通过倒置显微镜观察细胞形态；通过MTT法对肿瘤细胞增殖进行检测；通过细胞计数法检测细胞生长曲线；通过流式细胞仪检测细胞凋亡和坏死情况;通过甲基纤维素半固体集落形成实验检测细胞克隆形成能力；通过realtime PCR实验检测基因mRNA水平表达；通过免疫印迹实验(western blot)检测基因蛋白水平表达。实验结果为3次重复实验结果,用SPSS13.0软件和Graphpad软件进行数据分析。结果：与敏感性细胞株k562相比,ENO1在耐药细胞株k562/A02表达增高,其在mRNA水平和蛋白水平表达分别增高(2.85±0.56)倍和(1.43±0.05)倍。k562/A02细胞生长速率与k562细胞相比无显著性差异。本实验成功筛选3株稳定干扰ENO1的细胞株k562/A02-shENO1和对照细胞系k562/A02-shCON。3株k562/A02-shENO.1细胞与对照组k562/A02-shCON细胞相比生长速率均降低,对抗肿瘤药物紫杉醇和阿霉素的敏感性均增强。k562/A02-shENO1细胞对罗丹明123蓄积能力与对照组相比显著性增强,同时k562/A02-shENO1细胞中耐药相关基因MDR1表达水平在mRNA水平和蛋白水平均降低。甲基纤维素半固体集落形成实验发现,k562/A02-shENO1细胞中细胞克隆能力明显降低。结论：稳定干扰ENO1表达不仅能抑制k562/A02细胞生长和降低细胞群中干细胞比例,还能增强k562/A02细胞对抗肿瘤药物敏感性,降低其MDRl基因表达。实验表明,ENO1与k562/A02细胞耐药基因表达相关,ENO1可以作为k562/A02细胞克服耐药的靶点。
【学位单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位年份】：2014
【中图分类】：R96

【参考文献】