基于联合抑制MDR1和自噬多靶点修饰纳米粒逆转EGFR-TKI耐药的可能性及作用机制研究

发布时间：2020-09-18 09:09

　　 目的表皮生长因子受体(Epithelial growth factor receptor,EGFR)是一种具有酪氨酸激酶活性的细胞膜表面蛋白,通过与配体结合来激活。研究表明,它在大多数癌症患者中高表达,并且表达异常的EGFR信号通路在肿瘤发生、发展,侵袭和转移中起重要作用。吉非替尼(gefitinib)是一种常见的对EGFR起作用的酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine kinase inhibitors,TKI,EGFR-TKI),它可以有效预防实体瘤生长、侵袭、转移和血管生成,并促进肿瘤细胞凋亡。EGFR-TKI通常在恶性肿瘤的治疗中是成功的,特别是对于非小细胞肺癌,然而,经过一段时间的药物治疗后,肿瘤细胞变得对其并不敏感,治疗效果显著下降,这一现象被称为获得性耐药。因为获得性耐药的产生,所以显著降低了EGFR-TKI的治疗效果并限制其临床应用。目前对于临床上如何克服肿瘤患者对EGFR-TKI的耐药性还缺乏有效的治疗策略,通过前期研究我们发现耐药细胞株的多药耐药蛋白(multidrug resistance 1 gene,MDR1)和自噬水平明显升高,这些结果表明MDR1蛋白和细胞自噬可能在EGFR获得性耐药中发挥重要的作用。用特异性抗体封闭MDR1并降低其自噬水平可以明显增强耐药性肿瘤细胞对EGFR-TKI的敏感性。本研究拟将生物学的技术方法和纳米技术结合,选择SMMC-7721/geftinib细胞作为体外研究的细胞模型,通过构建MDR1单克隆抗体(monoclonal antibody against MDR1,mAb MDR1)修饰的壳聚糖纳米粒(nanoparticles,NPs),内部包裹gefitinib和自噬抑制物氯喹(chloroquine,CQ),在细胞水平检测SMMC-7721/gefitinib细胞对抗体修饰纳米粒的敏感性,探讨MDR1和自噬双重靶向的纳米粒逆转EGFR-TKI耐药的可能性及其分子机制。方法本研究首先建立了gefitinib和CQ含量的UV测定方法。以gefitinib、CQ、壳聚糖(Chitosan,CS)、多聚磷酸钠(Sodium polyphosphate,TPP)为原料,应用离子交联法制备共载gefitinib和CQ的壳聚糖纳米粒(gefitinib/CQ NPs),通过正负电荷互相吸引的作用将mAb MDR1修饰到其表面,制备gefitinib和CQ联合给药的MDR1抗体修饰壳聚糖纳米粒(gefitinib/CQ mAb MDR1-NPs),通过正交实验筛选制备gefitinib/CQ mAb MDR1-NPs的最优处方,并考察了纳米粒的形态、粒径、Zeta电位、包封率等理化参数以及纳米粒的体外药物释放模式。利用激光共聚焦显微镜观察了耐药肿瘤细胞对装载罗丹明B(Rhodamine B,RhoB)荧光染料的mAb MDR1修饰的壳聚糖纳米粒(mAb MDR1-NPs)的摄取情况,评估了抗体修饰后纳米粒的靶向性,通过内吞抑制实验对细胞的摄取机制进行了一定的探索。应用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)以及流式细胞凋亡技术检测了gefitinib、gefitinib+mAb MDR1、gefitinib+CQ、gefitinib+mAb MDR1+CQ、gefitinib NPs、gefitinib/CQ NPs、gefitinib mAb MDR1-NPs、gefitinib/CQ mAb MDR1-NPs对SMMC-7721/gefitinib细胞增殖及凋亡的影响,最后应用western blot方法检测了药物作用后的细胞中bax、cleaved caspase 3、cleaved PARP、LC3、MDR1蛋白的表达情况。结果本研究建立的gefitinib和CQ的UV定量分析方法的线性、精密度和回收率等均符合测定要求,可以用于两种药物体外含量测定。通过正交实验筛选出了制备gefitinib/CQ mAb MDR1-NPs的最优处方,且制得的纳米粒结构完整,为规则的球形,分散性良好,粒径较为均匀。Gefitinib/CQ NPs、gefitinib/CQ mAb MDR1-NPs中gefitinib和CQ的体外释放行为没有显著差别,呈现双相释放模式。通过激光共聚焦显微镜观察了SMMC-7721/gefitinib细胞对纳米粒的摄取过程,发现其具有时间依赖性,mAb MDR1-NPs有效地增强了MDR1过表达SMMC-7721/gefitinib细胞对纳米粒的摄取。内吞抑制实验结果表明小窝蛋白和胞饮作用是细胞对纳米粒内吞的主要途径,并且具有能量依赖性。MTT和流式细胞凋亡结果发现gefitinib/CQ mAb MDR1-NPs可显著抑制细胞增殖,诱导其凋亡。Western blot结果显示,gefitinib/CQ mAb MDR1-NPs处理耐药细胞后,SMMC-7721/gefitinib细胞的bax、cleaved caspase3、cleaved PARP蛋白表达水平明显升高,LC3和MDR1的表达水平下降,说明CQ和mAb MDR1可以协同促进gefitinib的抗肿瘤作用。结论Gefitinib/CQ mAb MDR1-NPs可以逆转EGFR-TKI获得性耐药,通过调控自噬和封闭MDR1的活性,增强抗肿瘤药物的摄取,显著的促进细胞凋亡。这表明在SMMC-7721/geftinib细胞中,自噬和MDR1可能是克服获得性耐药两个作用靶点,因此,联合抑制自噬和MDR1的临床应用可能是克服获得性EGFR-TKI耐药的重要策略之一。
【学位单位】：锦州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R943;R96
【部分图文】：

果如图 2-1 所示，gefitinib 溶液在 252 nm 处有最大紫外吸收峰，而 CDR1 混合溶液在此波长处没有吸收峰，由此确定 gefitinib 的检测波长。

2-2a CQ 溶液，2-2b CS 和 mAb MDR1 混合溶液的紫外光谱扫描图、标准曲线的确立1）Gefitinib 标准曲线的确立 gefitinib 标准品储备液稀释成不同浓度，以浓度 C 为 X 轴，吸光度 A

gefitinib溶液的标准曲线

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本文编号：2821450