SH-SY5Y细胞BPDE蛋白加合物研究

发布时间：2020-09-18 10:22

　　目的:采用药物亲和响应目标稳定性方法鉴定神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)中7,8-二羟-9,10-环氧苯并[a]芘(BPDE)的结合蛋白,并借助生物信息学分析的手段筛选与神经毒性密切相关的靶蛋白,为进一步研究苯并[a]芘(B[a]P)的神经毒性作用机制提供依据。方法:培养并收集人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y),提取蛋白并将裂解物的蛋白浓度调整为6g/L,等分为BPDE孵育组与DMSO溶剂对照组,分别与BPDE储备液和等体积DMSO混匀,室温孵育2h后,按比例加入嗜热菌蛋白酶进行消化,消化结束后一部分样品用SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白条带并染色,其余样品进行LC-MS/MS检测差异蛋白。对鉴定出的结合蛋白进行生物信息学分析,筛选出与神经毒性密切相关的靶蛋白。采用蛋白质印迹、细胞热变化分析的方法验证蛋白与BPDE的结合作用。结果:SDS-PAGA电泳结果显示BPDE孵育组与DMSO溶剂对照组之间的蛋白质条带没有明显差异。但添加嗜热菌蛋白酶消化后,在BPDE孵育组与DMSO溶剂对照组之间出现肉眼可见的差异条带。通过非标记定量蛋白质组学分析共鉴定出472种蛋白质,其中有69种蛋白质仅在DMSO溶剂对照组中出现,298种蛋白质仅在BPDE孵育组中出现。按照差异倍数2.0倍且P值0.05的标准(含仅在一组出现的蛋白),确定出428种结合蛋白,其中81.3%的结合蛋白在BPDE孵育组的含量显著高于对照组。对428种结合蛋白进行GO分析显示,生物过程主要涉及细胞反应及调控,其中注释到蛋白数目最多的分类主要涉及大分子、有机氮、蛋白质等代谢过程;细胞组分部分主要与细胞囊泡转运相关,蛋白数目最多的分类主要涉及细胞器、囊泡、细胞外泌体等。分子功能主要涉及分子间的结合作用,主要包括蛋白结合、RNA结合等,其中蛋白数目最多的分类主要涉及核酸结合、核苷酸结合、酶结合等。通过KEGG分析显示,涉及蛋白数目最多的分类为代谢与遗传信息处理。P值最显著的前10条KEGG信号通路为蛋白酶体、碳代谢、丙酮酸代谢、剪接体、内质网中的蛋白质加工、核糖体、RNA运输、氨酰基-tRNA生物合成、爱泼斯坦-巴尔病毒感染、糖酵解/糖异生信号通路。主要涉及神经细胞中的能量代谢、内质网中的蛋白质的合成、溶酶体、核糖体以及遗传信息处理方面。其他与神经毒性相关的通路还主要包括与细胞间信号传导、学习记忆有关的PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、长时程增强、cAMP信号通路、钙信号通路和与修复相关的核苷酸切除修复、错配修复、同源重组、基础切除修复以及与突触功能相关的突触小泡循环、多巴胺能突触、谷氨酸能突触、5-羟色胺能突触等。蛋白质相互作用分析发现,位于中心关键部位且联系紧密的蛋白主要涉及内质网中的蛋白质加工、神经细胞能量代谢、突触功能、神经细胞间的信号传导及学习记忆,结合GO功能分析与KEGG通路分析,筛选确定出40S核糖体蛋白S21、AP-2复合亚基α-2、酪蛋白激酶I同种型δ、酪蛋白激酶I同种型ε、40S核糖体蛋白S5、ATP合酶亚基α、AP-2复合亚基α-1、40S核糖体蛋白S14、转酮醇、紫外线切除修复蛋白RAD23A同系物A、40S核糖体蛋白S6、蛋白质二硫键异构酶A3、谷氨酸受体离子型NMDAR2A、苹果酸脱氢酶、60S核糖体蛋白L27、二氢硫辛酰脱氢酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、40S核糖体蛋白S2、网格蛋白重链、中性α-葡糖苷酶AB、丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2A65kDa调节亚基Aα同种型、40S核糖体蛋白S10、蛋白质二硫键异构酶A4、果糖二磷酸醛缩酶A、伸长因子2、60S核糖体蛋白L6、78kDa葡萄糖调节蛋白等可能位于神经毒性损伤相关信号通路关键点的26种蛋白为重点关注的BPDE靶蛋白。选择NMDAR2A蛋白和RAD23A蛋白进行验证。蛋白质印迹结果显示,当不添加嗜热菌蛋白酶消化时,BPDE孵育组的NMDAR2A蛋白和RAD23A蛋白相对含量与DMSO溶剂对照相比均无显著性差异;但在嗜热菌蛋白酶消化后,BPDE孵育组中NMDAR2A蛋白和RAD23A蛋白相对含量均明显高于DMSO溶剂对照组(P0.05)。细胞热变换分析表明,NMDAR2A蛋白的ΔTm=(7.35±1.74)℃,RAD23A蛋白的ΔTm=(9.64±2.42)℃,差异均有统计学意义(P0.05)。结论:BPDE结合可以改变结合蛋白对嗜热菌蛋白酶消化的敏感性,药物亲和响应目标稳定性方法可用于鉴定和筛选BPDE蛋白加合物。通过该方法共鉴定出可与BPDE结合的SH-SY5Y细胞蛋白428种,其中NMDAR2A、RAD23A等26种结合蛋白可能为BPDE神经毒性有关的重要靶蛋白。
【学位单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R99
【部分图文】：

工作流程图,工作流程图,蛋白质,软件

拼笱绌妒垦绗宦畚?0图 1 靶蛋白鉴定及验证的工作流程图1.4 统计学分析使用 SPSS22.0 软件对数据进行统计学分析，所有数据均以 x±s 表示，组间比较采用LSD法，蛋白质组学数据进行非标记定量计算采用MaxQuant软件中的 Labelfree 算法，其中检测差异倍数大于 2.0 倍且 P 值<0.05 的蛋白质与仅在其中一组检测到的蛋白质视为显著性差异蛋白质，即潜在靶点蛋白。GO 注释的显著性富集分析及 KEGG 通路富集分析通过 Fisher 确切概率法来评价。使用 GraphPad Prism 7.0 软件进行做图。

嗜热菌蛋白酶,消化条件,SDS-PAGE凝胶电泳,图谱

2.1 DARTS 最佳实验条件优化研究表明酶对蛋白质的消化能力存在药物浓度依赖性[28]，对于 BPDE 的给药浓度，尽可能保证有过量的 BPDE 去结合靶点蛋白。对于嗜热菌蛋白酶（Thermolysin）的比例，按照参考文献报道的蛋白：嗜热菌蛋白酶=15：1 的比例进行设定[28]，设置 5：1，10：1，15：1，20：1 的实验条件进行探索。研究结果表明，嗜热菌蛋白酶的最佳消化比例为蛋白：嗜热菌蛋白酶=10：1，肉眼可见差异蛋白条带，见图 2所示。在 DARTS 实验中，要求采用温和的裂解方式，尽可能保持蛋白原有的活性，在神经母细胞瘤细胞裂解物与药物孵育的过程中，要求静置、避免剧烈震荡，以免影响蛋白活性。电泳结束后，使用考马斯亮蓝染液进行凝胶颜色。在无嗜热菌蛋白酶消化的情况下，BPDE 孵育组与 DMSO 溶剂对照组相比，蛋白条带未见明显差异。在添加嗜热菌蛋白酶消化的情况下，BPDE 孵育组与 DMSO 溶剂对照组之间出现肉眼可见的差异条带。电泳结果见图 3。

嗜热菌蛋白酶,SDS-PAGE凝胶电泳,图谱,显著性差异

图 3 嗜热菌蛋白酶消化前后细胞裂解物 SDS-PAGE 凝胶电泳图谱注：图中箭头标注条带为差异条带。白质的质谱鉴定结果axQuant 是领先的蛋白质组学定性定量算法，近年来已经逐渐成内的标准解决方案之一[36]。我们采用 MaxQuant 软件中的 Labe组学数据进行非标记定量计算，在定量结果的显著性差异分析.0 倍且 P 值<0.05 的蛋白质视为显著性差异蛋白质。通过非标析方法共鉴定出 472 种蛋白质，其中 69 种蛋白仅在 DMSO 溶8 种蛋白仅在 BPDE 孵育组中出现，BPDE 孵育组和 DMSO 溶的蛋白质有 105 种，其中 61 种存在显著性差异，结果见图 4-A质中，最后确定存在显著性差异的蛋白有 428 种，即潜在靶点

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