新型微管去稳定剂抗肿瘤药物作用机制及肿瘤分子标志物GPC1的研究

发布时间：2020-09-18 16:31

　　食管癌是全球常见的肿瘤之一,五年生存率低,预后较差,缺乏有效的治疗手段,且化疗后易产生耐药。因此,寻找针对食管癌有效的小分子药物或筛选有效的分子标志物迫在眉睫。胰腺导管癌是恶性程度最高的恶性肿瘤,由于缺乏明显的早期症状,多数病人在初次诊断时已为中晚期或发生转移,因此迫切需要筛选胰腺癌早期诊断的分子标志物,以达到早诊早治的目的。本论文第一部分揭示了新型微管去稳定药物对食管鳞状细胞癌的抗肿瘤活性及作用机理。用三种新药SL-3-19、SL-1-73和IG-105在5种食管癌细胞上的增殖抑制实验结果显示,SL-3-19、SL-1-73和IG-105均能显著抑制食管癌细胞增殖。通过免疫荧光和免疫印迹分析发现,SL-3-19、SL-1-73和IG-105均可破坏食管癌细胞的成熟微管网络,抑制成熟微管的标志分子AC-α-Tubulin表达。进一步,选择SL-3-19进行深入机制探索。流式细胞分析发现,SL-3-19可诱导细胞周期G2/M期阻滞,增加凋亡细胞比例。免疫印迹显示SL-3-19可诱导Caspases家族分子的活化;而抑制抗凋亡蛋白Mcl-1、Bcl-2和ERK信号通路的p-ERK等分子的表达,结果提示SL-3-19可通过诱导G2/M周期阻滞,下调抗凋亡蛋白表达,促进食管癌细胞凋亡,阻遏MEK/ERK增殖通路的活化。体内外血管生成实验显示3种药物均能破坏肿瘤微血管,SL-3-19效果尤为突出。体内实验显示SL-3-19和SL-1-73均可抑制移植瘤生长,SL-3-19作用较强,且不造成裸鼠体重的显著变化和脏器损伤。总体而言,SL-3-19具有较低的IC50值、显著的体内外抗增殖活性及抗血管生成作用,提示SL-3-19可能成为未来食管癌治疗的候选药物。论文第二部分证明了 GPC1是胰腺导管腺癌的重要标志物。分析了来自癌症基因组图谱的178名胰腺导管腺癌患者的RNA测序数据,发现GPC1 mRNA在正常胰腺组织中不表达,而肿瘤组织中显著高表达。启动子甲基化分析提示GPC1启动子区低甲基化造成其在胰腺癌组织中的重新表达。186例胰腺导管腺癌的免疫组化分析显示,正常胰腺组织及癌旁组织中几乎不表达GPC1,而59.7%(111/186)肿瘤组织中GPC1阳性表达,在早期肿瘤组织中GPC1的阳性表达率为63.6%(34/55)。GPC1高表达与肿瘤低分化、较大的肿瘤直径正相关。Kaplan-Meier分析显示高表达GPC1与患者较短的总体生存时间显著相关(P = 0.0028)。多因素分析显示,GPC1是胰腺导管腺癌患者总生存时间的独立危险因素,风险比为1.82倍(= 0.0022)。结果提示,在胰腺癌肿瘤发生进程中,异位表达的GPC1可作为胰腺癌早期诊断和不良预后的标志,GPC1是一种非常有临床应用前景的标志物和治疗靶点。
【学位单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R96
【部分图文】：

曲线,细胞,曲线,细胞活力

为了进一步分析３种药物对食管癌细胞增殖能力的影响，我们选择ＫＹＳＥ邋５１０逡逑与ＫＹＳＥ邋３０细胞观察，采用０．０１、０．１、１、１０和２０逦的药物梯度处理４８邋ｈ后，逡逑ＣＣＫ－８法检狈Ｕ细胞活力。如图１－２和图１－３所示，三种ＭＴＡｓ药物处理ＫＹＳＥ邋５１０逡逑与ＫＹＳ邋Ｅ邋３０细胞４８邋ｈ后，细胞增殖均被显著抑制，且抑制作用呈现剂量依赖效应。逡逑ＳＬ－３－１９、ＳＬ－ｌ－７３邋与邋ＩＧ－１０５邋对邋ＫＹＳＥ邋５１０邋的邋ＩＣ５Ｑ邋分别为邋０．０４邋＿、２．０５邋＿邋和邋０．３２邋｜ｉＭ，逡逑对ＫＹＳＥ邋３０的ＩＣ５0值分别为０．０２邋＿１、５．３０邋和４．４６逦结果进一步提示食管逡逑癌细胞对ＳＬ－３－１９较ＳＬ－１－７３和ＩＧ－１０５更为敏感。逡逑ＫＹＳＥ邋５１０（４８ｈ）逡逑ｎｓ逦＊＊＊逡逑２逦＇＊＊逦□邋ＳＬ－３－１９逡逑２１００１邋．逦３逦□邋ＳＬ－１－７３逡逑Ｉ邋８０－邋ｉ邋Ｉ邋＊邋ＩＧ＇１０５逡逑Ｉ邋６０－邋１邋Ｉ邋Ｉ邋＾逡逑°逦０．０１逦０．１逦１邋ｉ0邋２0逡逑Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ邋（ｐＭ）逡逑图１－２邋ＫＹＳＥ邋５１０细胞对三种新型ＭＴＡｓ药物的剂量依赖曲线逡逑采用不同浓度的ＳＬ－３－１９、ＳＬ－１－７３和ＩＧ－１０５处理ＫＹＳＥ邋５１０细胞４８ｈ后

曲线,细胞系,细胞,食管

为了研究３种药物对食管增殖是否具有时间依赖性，选择ＫＹＳＥ５１０细胞，采逡逑用０．５邋ｎＭ的３种药物分别处理１２、２４、３６、４８和６０邋ｈ，ＣＣＫ－８法检测３种药物对逡逑ＫＹＳＥ邋５１０的时间依赖效应。如图１－４显示，随着３种药物作用时间延长，ＫＹＳＥ邋５１０逡逑细胞增殖能力越差，其中ＫＹＳＥ邋５１０细胞对ＳＬ－３－１９更敏感，处理４８邋ｈ时细胞存活逡逑率仅为２０％。与之前剂量依赖曲线联合分析，可知３种药物均可抑制食管癌增殖并逡逑对食管癌细胞呈现时间及剂量依赖效应。结合上述图表结果，后续主要选择对抗增逡逑殖活性较高的ＳＬ－３－１９做研究，将ＳＬ－１－７３或ＩＧ－１０５作为阳性对照，同时选择食管逡逑癌细胞ＫＹＳＥ邋５１０或ＫＹＳＥ邋３０进行后续实验。逡逑３２逡逑

细胞系,微管,细胞,药物

微管去稳定药物（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ－ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ邋ａｇｅｎｔｓ，邋ＭＤＡｓ）邋ＩＧ－１０５邋是邋ＳＬ－３－１９邋和逡逑ＳＬ－１－７３是的母体化合物［２］。ＫＹＳＥ邋５１０细胞经免疫荧光染色后，在激光共聚焦显微逡逑镜下观察药物对食管癌细胞微管的影响。如图１－５所示，未加药对照组中ＫＹＳＥ邋５１０逡逑细胞微管以一种有序的方式排列，包绕在细胞核四周。当使用三种药物中的任何一逡逑种处理食管癌细胞６ｈ后，随着药物浓度增加，完整的微管网逐步消失了。尤其是逡逑ＳＬ－３－１９组在２０邋ｎＭ时破坏效果十分显著，而ＩＧ－１０５或ＳＬ－１－７３邋（１００邋ｎＭ）的活性逡逑较弱，这与之前二者具有较高ＩＣ５。值的结果一致。此外，图１－６所示，采用１００ｎＭ逡逑ＳＬ－３－１９与ＩＧ－１０５处理ＫＹＳＥ邋３０细胞，微管破坏也非常明显。逡逑３３逡逑

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