Caspase11及TNFAIP3炎性通路在甲基苯丙胺诱导的神经毒性中的作用研究

发布时间：2020-09-19 13:23

　　研究背景:甲基苯丙胺(Methamphetamine,METH)是世界上滥用最广泛的药物之一,主要效应器官是中枢神经系统。METH可导致大脑以多巴胺神经元为主的脑区损伤,神经细胞出现变性、坏死。METH还可致神经胶质细胞的炎性损伤,产生星形胶质细胞活化、诱导小胶质细胞聚集、释放炎症因子、胶质瘢痕增生等改变。在METH神经毒性损伤的众多机制中,神经炎性损伤的作用尚不明确。星形胶质细胞作为中枢神经系统数量最多的神经胶质细胞,具有多种功能,在保护神经元等方面发挥重要作用,其被激活后能诱导小胶质细胞分化,产生多种细胞因子,并参与炎性反应。因此我们推测,星形胶质细胞在METH神经炎性损伤中同样发挥着不容忽视的作用。研究表明,Toll样受体(Toll like receptor,TLR)、Caspase11 以及NLRP3炎性体组成的经典与非经典的炎性通路在免疫应答反应中发挥重要作用。而TLR4引起下游NF-κB通路的过度激活,也可能是一些自身免疫性疾病发病的原因,A20作为NF-κB的胞内抑制因子,在炎性通路调节中起到关键作用,可能成为METH神经毒性的治疗靶点。综上所述,我们开展了 METH与星形胶质细胞相关研究。研究目的:本课题拟研究METH诱导的星形胶质细胞激活的机制,星形胶质细胞炎性通路变化及其在神经元毒性损伤中的作用和调控机制。实验方法:通过建立METH染毒原代培养的星形胶质细胞及U87MG细胞模型,METH染毒动物亚急性中毒模型,通过形态学、分子生物学、基因干扰与过表达等技术,探讨炎性通路TLR4—Caspase11—NLRP3炎性体和A20—NF-κB的表达水平。另外通过建立METH染毒星形胶质细胞—神经元共培养模型,探讨METH作用下两种细胞的相互作用关系。实验结果:1.METH染毒星形胶质细胞促炎因子IL-1β和IL-18高表达,Caspase11—NLRP3炎性体非经典炎性通路激活;2.原代培养的星形胶质细胞给予METH处理后,TLR4可以通过Myd88依赖和非依赖的途径,介导NF-κB表达上调及入核增加,从而介导Caspase11及NLRP3炎性体通路相关蛋白的转录增加;3.建立星形胶质细胞与神经元共培养联合METH给药模型,星形胶质细胞可以显著降低共培养模型中由METH诱导的神经元的凋亡、自噬、氧化应激及DNA损伤水平;4.METH染毒细胞模型中,通过建立A20过表达和干扰稳转细胞株,发现A20能够抑制TRAF6,也可以抑制NF-κB通路下游因子表达。结论:1.Caspase1 1通过炎性小体途径促进METH诱导的促炎因子表达;2.METH通过TLR4-NF-κB-Caspase11通路诱导星形胶质细胞的激活;3.METH染毒的星形胶质细胞与神经元共培养后,神经元的凋亡、自噬及氧化应激水平显著下调;4.星形胶质细胞在METH染毒后炎性通路被激活,A20通路同样被激活。且对星形胶质细胞A20进行过表达后,对细胞炎性通路有显著抑制作用。
【学位单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R99
【部分图文】：

亚急性中毒,小鼠,星形胶质细胞,中脑

图１－１邋ＭＥＴＨ亚急性中毒小鼠中脑和纹状体星形胶质细胞变化逡逑ＢＬ邋／邋６小鼠随机分成对照组和实验组（ｎ邋＝邋５）。给动物腹腔注射生理／针，每隔１２邋ｈ注射一次，共８针）。注射完毕后２４邋ｈ之后脱颈行ＧＦＡＰ免疫组织化学染色。比例尺：５0ｈｍ逡逑ｈａｎｇｅｓ邋ｏｆ邋ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｍｉｄｂｒａｉｎ邋ａｎｄ邋ｓｔｒｉａｔａｌ邋ｏｆ邋ＭＥＴＨ邋ｓｕｂａｃｕｔｍｉｃｅ逡逑邋／邋６邋ｍｉｃｅ邋ｗｅｒｅ邋ｒａｎｄｏｍｌｙ邋ｄｉｖｉｄｅｄ邋ｉｎｔｏ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｇｒｏｕｐ邋ａｎｄ邋ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ邋ｇｅ邋ｉｎｊｅｃｔｅｄ邋ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｌｙ邋ｗｉｔｈ邋ｓａｌｉｎｅ邋ｏｒ邋ＭＥＴＨ邋（１５邋ｍｇ／ｋｇ／ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ，邋８ｓ）．邋Ｔｈｅ邋ｍｉｃｅ邋ｗｅｒｅ邋ｓａｃｒｉｆｉｃｅｄ邋ｂｙ邋ｃｅｒｖｉｃａｌ邋ｄｉｓｌｏｃａｔｉｏｎ邋２４邋ｈ邋ａｆｔｅｒ邋ｔｈｅ邋ｌａｓｔ邋ｉ邋ｅｘｔｒａｃｔｅｄ邋ｆｏｒ邋ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｏｆ邋ＧＦＡＰ．邋Ｓｃａｌｅ邋ｂａｒ：邋５０邋｜ｉ诱导星形胶质细胞中促炎因子ＩＬ－ｉｐ和ＩＬ－１８的表达逡逑一步确定ＭＥＴＨ处理后体内及体外炎性反应程度，我们两个白介素因子进行检测。ＩＬ－１（３和ＩＬ－１８均是促炎细胞中发挥重要作用。Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ结果显示，ＭＥＴＨ亚急性

星形胶质细胞,纹状体,蛋白表达,小鼠

ｐｒｏｔｅｉｎ，邋ＧＦＡＰ）免疫荧光染色进行鉴定。ＧＦＡＰ是星形胶质细胞特异性的骨架蛋逡逑白，胶质纤维酸性蛋白，结果显示原代培养的星形胶质细胞纯度超过９５％，可逡逑以用于后续试验（图１－３）。逡逑３１逡逑

星形胶质细胞,形态变化

逡逑图１－３原代星形胶质细胞纯度鉴定逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－３邋Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｐｒｉｍａｒｙ邋ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ逡逑我们观察到，ＭＥＴＨ暴露后原代星形胶质细胞的形态发生了显著变化。光逡逑镜下发现星形胶质细胞的细胞体中出现液泡样分泌囊泡。通过Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ检测逡逑星形胶质细胞ＩＬ－ｉｐ和ＩＬ－１８蛋白表达，发现其表达量与ＭＥＴＨ剂量依呈现高度逡逑赖性（图１－４）。这些数据表明ＭＥＴＨ暴露在体内体外均可激活星形胶质细胞，逡逑并诱导促炎因子的表达。逡逑Ｃｔｒｌ逦ＭＥＴＨ邋（２ｍＭ．２４ｈ）逡逑？邋？１邋ｔ＝ｌ邋Ｌ－ｉｐ逦？逡逑＼邋Ｉ＇邋？、逦／逦？＇逦ＭＥＴＨ邋０邋０．５逦１０邋１．５邋２．０逦２．５邋ｍＭ邋｜逦？邋１邋１８逦圈逡逑ｉｉＵｏＤｏＪｉ逡逑ｙ／逦逦逦邋ＭＥＴＨ邋０邋０邋５邋１邋０．５邋２邋０．５逦０邋０．５邋１邋０．３邋２邋０．９邋ｍＭ逡逑图１＞４原代培养的星形胶质细胞ＭＥＴＨ给药后的形态变化和ＩＬ－ｉｐ和ＩＬ－１８蛋白表达水平逡逑将原代培养的星形胶质细胞用不同浓度的ＭＥＴＨ处理２４邋ｈ（０

【相似文献】