艾瑞昔布对CYP2C9酶的抑制作用及表达的影响

发布时间：2020-09-23 07:12

　　多种疾病的发生过程都伴有炎症反应,全球每年约有上亿炎症患者忍受着病痛的折磨。艾瑞昔布为新型COX-2的选择性抑制剂,对急性和慢性炎症具有良好治疗作用。最近研究发现,艾瑞昔布与CYP2C9底物药物联用能够改变其代谢,但其对CYP2C9酶的作用尚不明确,相关体内、外实验的文献报道结论不一致。有文献报道,大鼠连续灌服艾瑞昔布,能使同时服用的甲苯磺丁脲代谢加快,表现出艾瑞昔布对CYP2C9酶的诱导作用;然而,在另一体外肝微粒体实验中,艾瑞昔布却表现出对CYP2C9轻微抑制作用。那么,艾瑞昔布对CYP2C9酶究竟是诱导作用还是抑制作用,长期服用是否会对经CYP2C9酶代谢的药物产生影响,这是目前需要明确的问题。本实验拟通过体内、体外两部分实验探究艾瑞昔布对CYP2C9酶的影响,并对其作用机制进行初步研究,旨在为艾瑞昔布的临床合理用以及避免不良药物相互作用提供理论依据。第一部分艾瑞昔布对肝微粒体孵育体系中CYP2C9酶的影响目的:建立肝微粒体中4-羟基甲苯磺丁脲含量的UPLC测定方法通过测定CYP2C9肝微粒体孵育体系中4-羟基甲苯磺丁脲含量探究艾瑞昔布对CYP2C9酶活性的影响。方法:UPLC色谱条件:ACQUITY UPLC?BEH-C_(18)色谱柱(2.1×50mm,1.7μm),柱温30℃,流动相为水-乙腈(V/V=76:24),流速0.4 mL/min,检测波长235 nm,进样量2μL,内标为卡马西平。肝微粒体孵育体系500μL,加入甲苯磺丁脲50μM,于37℃水浴中孵育后终止反应,加入卡马西平工作液5μL混匀,用乙酸乙酯1500μL萃取,取上清液1250μL吹干,甲醇50μL复溶,取上清液,UPLC法测定大鼠肝微粒体孵育体系中甲苯磺丁脲代谢产物4-羟基甲苯磺丁脲的含量;采用单因素法对肝微粒体孵育蛋白浓度与孵育时间进行优化,通过加入艾瑞昔布前后肝微粒体孵育体系中4-羟基甲苯磺丁脲含量变化分析艾瑞昔布对CYP2C9酶功能的影响。结果:1.建立了肝微粒体中4-羟基甲苯磺丁脲含量的UPLC测定法,该方法标准曲线方程为:Y=0.1024X-0.0107,在0.3125-20μg/mL范围内线性关系良好,专属性、定量下限、精密度和回收率以及稳定性均满足生物样品检测要求。2.筛选并优化了肝微粒体孵育条件:最终选择1 mg/mL作为肝微粒体孵育蛋白浓度,以60 min作为肝微粒体孵育时间。3.体外肝微粒体孵育实验显示,随着艾瑞昔布浓度的升高,4-羟基甲苯磺丁脲生成量相对空白组有所降低,拟合结果表明艾瑞昔布对CYP2C9活性的抑制作用剂量依赖性增强,其IC_(50)为74.77μM。小结:本研究建立了大鼠肝微粒体孵育体系中4-羟基甲苯磺丁脲含量的测定方法,肝微粒体孵育实验结果表明,艾瑞昔布对大鼠肝微粒体CYP2C9酶有一定抑制作用,但其IC_(50)远高于临床血药浓度,推测在临床用量下艾瑞昔布对CYP2C9酶的直接抑制作用较弱。第二部分艾瑞昔布对大鼠肝脏中CYP2C9酶的影响及表达的影响目的:测定大鼠连续灌胃艾瑞昔布后肝脏CYP2C9酶的蛋白与mRNA表达的变化,初步探究艾瑞昔布对CYP2C9酶的影响及其机制。方法:大鼠随机分组,连续灌胃不同天数的艾瑞昔布(10 mg/kg)或等体积的空白溶剂。在最后一次灌胃结束后取出肝脏,运用Western Blot和RT-PCR探究艾瑞昔布对大鼠肝脏CYP2C9酶蛋白及mRNA表达的影响。结果:Western Blot实验结果显示,随着艾瑞昔布灌胃时间的延长,大鼠肝脏CYP2C9条带逐渐变浅,灌胃第1天、第7天、第14天的CYP2C9蛋白表达分别为对照组的80%、37%和34%,均有明显统计学差异(P0.05);PCR实验结果显示,随着艾瑞昔布灌胃时间的延长,大鼠肝脏CYP2C9 mRNA表达明显降低,灌胃第1天、第7天、第14天CYP2C9酶mRNA表达分别为对照组的65%、35%和34%,均有明显统计学差异(P0.05)。小结:随着艾瑞昔布灌胃时间的延长,大鼠肝脏CYP2C9酶的蛋白表达及mRNA表达逐渐降低,蛋白与基因表达结果具有一致性,表明艾瑞昔布可能是通过调控了mRNA的表达导致酶蛋白合成减少。结论:本研究建立了大鼠肝微粒体孵育体系中4-羟基甲苯磺丁脲含量的UPLC测定方法,筛选、优化得到合适的肝微粒体孵育体系。体外肝微粒体实验表明,艾瑞昔布对大鼠肝微粒体CYP2C9酶具有一定的抑制作用,但其IC_(50)值远高于艾瑞昔布在临床用药时体内的血药浓度,故认为其对CYP2C9酶直接抑制作用较弱。动物整体给药时,随着灌胃给予艾瑞昔布时间的延长,大鼠肝脏CYP2C9酶的蛋白表达和mRNA的表达逐渐降低,二者调控具有一致性,提示艾瑞昔布可能是在转录过程中影响了mRNA的表达,导致该酶蛋白合成减少。
【学位单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R965
【部分图文】：

液相色谱图

18图 1 超高效液相色谱图hromatograms of UPLC. A: Blank liver microsomal oxytolbutamide, C: Carbamazepine，D: Tolbutamide, E: Imcal sample 1: 4-Hydroxytolbutamide, 2: Carbamazepine,

标准曲线,丁脲,标准曲线,精密度

图 2 4-羟基甲苯磺丁脲标准曲线Fig.2 Standard curve of 4-hydroxytolbutamide、高（0.625、2.5、16 μg/mL）三种不同浓度的 4内精密度和日间精密度结果见 Table 1。表 1 4-羟基甲苯磺丁脲测定精密度结果（n=5）Table 1 Precision of 4-Hydroxytolbutamidetest (n=5tion)Intra-day Inter-daMean±SD(μg/mL)RSD/%Mean±SD(μg/mL) 0.59±0.04 8.05 0.63±0.05

曲线,丁脲,浓度关系,生成量

体系的优化白液浓度的选择磺丁脲的生成量-蛋白液浓度关系分别见 Fig.验条件范围内，随着孵育蛋白浓度的增加，4逐渐增加，在 0.3-1 mg/mL 增加明显，当蛋白基甲苯磺丁脲的产量上升变缓，因此，选择液最佳浓度。

【参考文献】