纳米晶技术增加难溶性药物的透膜性和跨膜转运的机理研究

发布时间：2020-09-24 04:43

　　难溶性化合物的制剂学研究是新药研发的重大难题。据统计,药物发现阶段有高达70～80%的活性成分均存在水溶性差的问题,如何利用制剂学的手段来提高这些活性分子的生物利用度对药剂工作者来说是一个巨大的挑战。纳米晶技术是近年来兴起并逐步应用于工业化生产的新兴技术,它是仅由药物晶体与少量稳定剂形成的亚微米胶体分散体系,可以显著改善难溶性药物的溶解度和溶出速度。由于只含有少量稳定剂,纳米晶的理论载药量可高达100%,且与纳米载体药物相比,纳米晶在药物输送能力和稳定性方面更优越,毒副作用更低。此外,纳米晶剂型丰富,涵盖口服、经皮、注射等多种途径给药,为药物的临床应用提供了更多选择。截止到目前,有17个纳米晶制剂品种已批准上市,超过20种产品正在进行临床试验。在过去的二十年中,纳米晶被认为是最成功的纳米技术药物之一。目前有关纳米晶的研究主要集中在制备与表征,机制研究较少。大多数纳米晶制剂的制备和优化是基于操作的可行性,仅仅是处方组成及工艺参数范围的考察,缺乏体内机制研究,难以支持与指导合理处方的开发。纳米晶制剂多为口服制剂,但其胃肠道的吸收机制至今极少报道。现在一部分研究者认为溶解度和溶出速率的增加是纳米晶制剂提高生物利用度的最关键因素,也有一些研究人员认为纳米晶的吸收遵循与其他纳米载药系统类似的原理,即主要以内吞的形式被细胞摄取,然而还缺少令人信服的数据来直接支持这些假设,因此有必要对纳米晶胃肠道的吸收机制进行系统地研究。全面认识和掌握纳米晶在胃肠道的跨膜转运特点和口服吸收机制,对纳米晶口服制剂的合理开发与优化有重要指导作用。为此,本课题开展了系统的纳米晶制剂作用机制研究。首先在细胞水平上考察纳米晶跨膜转运机制,阐明基于细胞表面吸附、细胞顶膜摄取、细胞器定位以及细胞底膜排出的纳米晶跨膜转运的机理;在此基础上,从器官水平考察纳米晶在不同肠段的运输特点和作用机制;进而在活体动物水平验证体内外结果的相关性,得出规律性结论。并且在研究纳米晶跨膜转运机理的同时,还考察了由量变带来的生物学效应的不同。通过不同层次不同水平的研究,全面阐明纳米晶的跨膜转运特点和口服吸收机理。本课题研究内容和结果总结如下:1.三种纳米晶三种粒径的制备。采用沉淀法制备了三种不同粒径的香豆素-6纳米晶,带正电,呈球形。建立了香豆素-6纳米晶的荧光分析方法,线性良好,定量限满足实验的需求。采用湿磨法制备了三种不同粒径的阿瑞匹坦纳米晶,带负电,呈矩形。建立了阿瑞匹坦纳米晶的LC-MS/MS方法,线性良好,定量限满足实验的需求。采用湿磨法制备了三种不同粒径的槲皮素纳米晶,带负电,呈锥形。三种模型药的粒径都约为200 nm、500 nm、3 μm。2.纳米晶与细胞表面吸附环节。纳米晶可以快速有效地吸附在细胞表面,并引发细胞的内吞作用,粒径越小,与细胞的吸附作用越强,但粘附剂和表面电荷会影响此过程。香豆素-6纳米晶带正电,细胞吸附呈粒径依赖。阿瑞匹坦纳米晶带负电,吸附效率较低,由于制备中引入粘附剂HPC-SL,三个粒径组的细胞吸附无显著性差异。3.纳米晶在细胞顶膜的摄取环节。纳米晶可以以晶体的形式被细胞内吞,该过程涉及多种蛋白介导途径,并且呈浓度、时间、粒径、温度依赖趋势;粒径不仅从速度和程度上影响纳米晶的摄取,还影响纳米晶的内吞方式。微米粒径的内吞更多依赖于巨胞饮,纳米粒径的内吞介导途径更多元化,涉及网格蛋白和小窝蛋白介导的内吞以及巨胞饮,肌动蛋白也参与此过程,这可能是其细胞摄取效率高的原因。4.纳米晶在细胞内的共定位环节。纳米晶经细胞内吞后主要集中于溶酶体内,大部分被溶酶体代谢,与有关外排分泌的高尔基体、内质网的共定位不明显,跨膜转运的效率可能并不高。5.纳米晶在穿细胞底膜环节。纳米晶可以以晶体形式实现穿细胞过程,细胞旁路作用不明显。并且制备成纳米晶后,可以显著改善BCS Ⅳ类药物的透膜性,粒径越小,效果越好,其机制涉及药物的被动扩散和多种蛋白介导的内吞途径。但纳米晶的整体跨膜效率并不高,可能与纳米晶在细胞内较少参与内质网和高尔基体的再修饰有关。6.采用离体肠外翻模型和在体肠灌流模型研究纳米晶的肠道吸收特性。阿瑞匹坦纳米晶在十二指肠处有最大吸收,微米粒径最大吸收在空肠处,纳米晶可以在速度和程度上提高药物的肠道运输。并且随着药物浓度的增加,吸收有饱和现象,纳米晶增加难溶性药物的肠道吸收是被动扩散和多种蛋白介导的内吞途径共同作用的结果。7.在活体水平考察了纳米晶在大鼠体内的药代动力学特征。大鼠给药不同粒径的阿瑞匹坦纳米晶后,小粒径纳米晶的AUC和Cmax都显著提高,Tmax缩短,纳米晶改善了难溶性药物的吸收速度和程度,并且粒径越小,改善程度越高。8.纳米晶可以改善难溶性药物的生物学效应。槲皮素纳米晶可以在分子和细胞水平上抑制肿瘤细胞的增殖、粘附、迁移和侵袭,且具有浓度和时间依赖性,其机制可能与抑制了STAT3蛋白表达有关。并且粒径越小,作用越明显,这可能是纳米晶增加了其溶解性和跨膜转运能力的结果。综上所述,纳米晶可以改善难溶性药物的口服吸收和生物利用度,这是纳米晶增加难溶性药物的溶解性和透膜性共同作用的结果,其机制与药物在胃肠道的被动扩散以及多种蛋白介导的内吞途径有关。对于渗透性差的BCS Ⅳ类药物,纳米晶不仅可以提高其溶解性,也是改善该药物透膜性的有效方法,但改善的效率有待进一步的提高。针对这一点,可以从纳米晶跨膜转运的具体环节进行优化设计。纳米晶与细胞表面吸附环节,粒径减小表面能增大带来的被动吸附、电荷修饰、粘附剂的添加以及靶向细胞膜特异受体的配体-受体相互作用等,都可以加强纳米晶的细胞吸附,进而引发细胞的内吞作用。在纳米晶跨膜转运环节,对于细胞旁路途径,壳聚糖、聚丙烯酸酯等可打开分子间的紧密连接,增加细胞间的渗透;对于穿细胞途径,一方面可以针对多种内吞蛋白介导途径对纳米晶表面进行配体修饰,增加内吞的效率,另一方面可以将具有溶酶体逃逸功能的材料,如聚乙烯亚胺、树枝状聚合物等引入到纳米晶结构中,减少纳米晶制剂在溶酶体的代谢,提高纳米晶的跨膜转运效率,进而增强难溶性药物的口服吸收和生物利用度。本研究探讨了纳米晶增加难溶性药物跨膜转运和口服吸收的作用机制,并为纳米晶制剂的合理设计与优化提供了重要思路,同时也为纳米晶制剂在生物医药领域的应用奠定了一定的理论基础。本论文有如下的新发现或创新点:1.本课题从细胞水平、器官水平到活体动物水平三个层面系统地研究了纳米晶的跨膜转运特点和口服吸收机理,体内外验证了纳米晶提高难溶性药物口服吸收和生物利用度是溶解性和内吞作用共同提高的结果。这一发现为纳米晶跨膜转运和口服吸收的机理研究,提供了重要的依据。2.初步阐明了纳米晶在细胞表面吸附、细胞顶膜摄取、细胞器定位、跨膜转运途径几个环节的作用方式和特点,针对这些环节的影响因素,可以有针对性地优化纳米晶的设计,为纳米晶的开发和应用提供合理的指导作用。3.明确了亚微米级粒径对纳米晶跨膜转运和口服吸收的影响,为纳米晶粒径的选择和优化指明道路。
【学位单位】：军事科学院
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R943
【部分图文】：

过程图,给药系统,胃肠道,屏障

军事科学院博士学位论文中性颗粒比带电颗粒能更好地穿过黏液层[24]；黏蛋白纤维相互交织结构对于纳米颗粒也起到了空间位阻的效应[25]。因此，对于纳米颗、疏水性和电荷正负性等性质决定了其与黏液层的相互作用和透过能细胞黏液层下面是上皮细胞，细胞层中有肠上皮细胞、杯状细胞和微褶皱细胞（M 细胞），细胞间有紧密连接，细胞层下为基底层、平滑肌细胞、神经和血管[26]。纳米颗粒穿透上皮细胞屏障需要通过细胞）或细胞旁路（细胞间）途径，同时可能需要克服外排泵的8]（图 1.1）。纳米颗粒的跨上皮细胞方式主要有被动扩散、主动转运，其中 M 细胞允许颗粒以整体形式通过[29]。颗粒的理化性质不同，能不同。而对于细胞旁路转运，纳米颗粒经细胞旁路转运需要克服接。细胞的紧密连接是一种多蛋白复合体，它在胃肠道上皮细胞之择性渗透的闭合小带[30]。颗粒穿过紧密连接依赖于紧密连接孔径的连接的形成过程中发现其完整性依赖于钙离子，钙离子去除后可引蛋白重排和孔径增大，减弱紧密连接的屏障功能[26]。

纳米颗粒,机制,胃肠道,纳米

军事科学院博士学位论文谢酶和 P-gp 共存，大大加强了药物的代谢，导致药物的口服生物利用度降低[32]。由此可见，药物口服生物利用度低的原因可以归纳为：（1）药物经胃肠道化学作用被破坏，尚未到达上皮细胞，生物活性已减弱或消失。（2）药物的理化性质如水/脂溶性、粒径或相对分子质量等不合适，通过胃肠道物理屏障的能力差。（3）药物是肠道代谢酶或外排转运体的底物，难以通过胃肠道生化屏障。其中，药物的溶解性和透膜性是影响药物口服吸收的关键，对口服药物的吸收起限速作用[33]。(二) 口服纳米给药系统的胃肠道吸收机制目前报道的口服纳米制剂的主要吸收途径有以下三种[34]：（1）细胞旁路转运，（2）穿上皮细胞转运，（3）经回肠内集合淋巴结的 M 细胞转运。其中 M 细胞的转运吸收被认为是口服纳米制剂的主要吸收途径[35]。另外，纳米制剂在经过胃肠道的过程中，部分药物可能释放出来，并同游离药物一样被动扩散进入血液循环。此外还有其他一些细胞质膜损伤、挤压吸附和受体介导的主动转运等吸收途径[12]，以上机制可同时运转（图 1.2），构成了纳米制剂吸收的主要途径。

纳米颗粒,途径

的孔径范围为 0.3~1.0 nm[36]，即使完全打开，也不超过制剂来说尺寸太窄，无法实现穿越[37]。许多研究表明动态的，肌动蛋白的收缩、细胞外钙离子浓度的降低壳聚糖通过电荷介导作用可使紧密连接蛋白结构重组[38]，聚丙烯酸酯可降低细胞外钙离子的浓度促进纳米制剂经细胞旁路转运可增加吸收，但转运效率并不高。细胞转运纳米颗粒的摄取有吸附、融合、膜间转运和内吞等方米颗粒穿细胞转运的主要机制。纳米颗粒的内吞作用 1.3），主要包括网格蛋白和小窝蛋白介导的内吞以及巨被包裹在囊泡中，然后被运输至早期内吞体（EEs）。溶酶体中累积并被溶酶体代谢[42]，少量的纳米颗粒可分纳米颗粒可以通过高尔基体（GC）和内质网（ER）纳米颗粒的跨上皮细胞转运是一个复杂的过程，需要进。

【相似文献】