肿瘤细胞多亚细胞室递送阿霉素酸敏胶束的制备及其抗肿瘤活性研究

发布时间：2020-09-24 05:32

　　阿霉素(doxorubicin,DOX)是一种疗效确切且价格低廉的广谱抗肿瘤药物,但严重的毒副作用而且肿瘤细胞对其易产生耐药,限制了DOX临床应用。因此建立肿瘤靶向、可逆转耐药、并能在肿瘤细胞内有效释放DOX的递药系统是目前研究的热点。叶酸受体(folate receptor,FR)在多种肿瘤细胞表面高表达,经叶酸修饰的递药系统具有肿瘤主动靶向功能。当肿瘤细胞对DOX产生耐药时,DOX被快速泵出肿瘤细胞,不能到达细胞核发挥作用。研究表明,线粒体也是DOX的作用靶点,如果能将DOX定向递送至线粒体,可有效逆转耐药,提高DOX的抗肿瘤作用。大分子递药系统进入肿瘤细胞后首先分布于内涵体/溶酶体等酸性细胞器中,具有酸敏特性的递药载体可实现药物的胞内定位突释。目的:本研究利用脂性阳离子(3-丙羧基)三苯基溴化膦(TPP)对线粒体具有高亲和力的特性,制备具有线粒体靶向功能的连接物TPP-DOX,并将DOX和TPP-DOX同时包封于叶酸(folic acid,FA)修饰的酸敏聚合物胶束中,以期得到高效、低毒、控释、有效逆转耐药的DOX聚合物胶束,提高DOX的抗肿瘤作用。方法:以DOX和TPP为原料合成TPP-DOX。以棕榈酸(palmitic acid,PA)、聚天门冬氨酸(polyaspartic acid,Pasp)、叶酸(FA)、聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)等为原料,采用腙键将亲水材料和亲脂材料连接,合成酸敏聚合物材料PA-hyd-PEG-FA和Pasp-hyd-PEG-FA。通过核磁、质谱、红外等方法鉴定化合物结构。分别采用乳化-溶剂挥发法和透析法制备同时包封DOX和TPP-DOX的酸敏胶束DOX/TPP-DOX@PA-hyd-PEG-FA和DOX/TPP-DOX@Pasp-hyd-PEG-FA,并对胶束进行表征。将载药胶束分散于不同p H值的磷酸盐缓冲溶液中,观察胶束的体外释药特性。采用MTT法研究载药胶束的体外抗肿瘤活性。采用试剂盒法考察载药胶束对肿瘤细胞凋亡的诱导作用。采用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜观察肿瘤细胞对胶束的摄取,以及DOX在肿瘤细胞亚细胞室的分布情况。建立荷瘤裸鼠模型,考察载药胶束的体内抗肿瘤活性,并采用活体成像仪观察DOX在荷瘤裸鼠体内的分布。结果:1.波谱学鉴定结果显示合成产物波谱学特性符合目标产物特征。2.DOX/TPP-DOX@PA-hyd-PEG-FA粒径为237 nm,DOX和TPP-DOX的载药量分别为8.6%和10.3%,在p H7.4条件下放置4天,胶束粒径未发生明显变化。DOX/TPP-DOX@PA-hyd-PEG-FA在p H值7.4、6.5以及5.0的磷酸盐缓冲溶液中孵育72 h后,DOX的累积释放百分率分别为52%、67%以及86%,TPP-DOX的累积释放百分率分别为51%、65%以及95%,呈现出明显的p H依赖性。MTT实验证实,空白胶束无明显细胞毒性。DOX/TPP-DOX@PA-hyd-PEG-FA通过叶酸受体介导进入细胞,与游离DOX相比,其细胞毒性显著增加,对耐DOX肿瘤细胞MCF-7/ADR仍表现出较强的细胞毒性。细胞凋亡实验结果显示,DOX/TPP-DOX@PA-hyd-PEG-FA可显著增加肿瘤细胞Caspase 3含量。荧光显微镜和激光共聚焦显微镜结果表明,载药胶束可将DOX高效递送至肿瘤细胞内,并实现DOX的线粒体和细胞核定位分布。DOX/TPP-DOX@PA-hyd-PEG-FA可提高DOX在肿瘤组织的分布,剂量依赖性地抑制荷瘤(MCF-7/ADR细胞)裸鼠肿瘤生长,其体内抗肿瘤活性明显优于游离DOX,并且降低了DOX的毒副作用。3.DOX/TPP-DOX@Pasp-hyd-PEG-FA(Pasp:PEG=1:10)的粒径为193 nm,DOX的载药量为7.9%,TPP-DOX的载药量为12.4%。在p H7.4条件下放置30天,胶束的粒径未发生明显改变。MTT实验证实,空白胶束无明显细胞毒性。DOX/TPP-DOX@Pasp-hyd-PEG-FA(Pasp:PEG=1:10)体外释药具有明显的p H依赖性,对叶酸受体高表达的KB细胞及耐DOX的MCF-7/ADR细胞均显示出较强的细胞毒性,且呈现显著的诱导凋亡活性。荧光显微镜和激光共聚焦显微镜结果显示,DOX/TPP-DOX@Pasp-hyd-PEG-FA(Pasp:PEG=1:10)可将DOX转运至细胞核和线粒体。静脉注射给予DOX/TPP-DOX@Pasp-hyd-PEG-FA(Pasp:PEG=1:10)后,DOX主要分布于荷瘤(KB细胞)裸鼠肿瘤组织,表现出良好的肿瘤靶向特性。DOX/TPP-DOX@Pasp-hyd-PEG-FA(Pasp:PEG=1:10)可剂量依赖性的抑制荷瘤裸鼠肿瘤的生长,其体内抗肿瘤活性明显强于游离DOX,降低了DOX的心脏毒性。结论:DOX/TPP-DOX@PA-hyd-PEG-FA和DOX/TPP-DOX@Pasp-hyd-PEG-FA(Pasp:PEG=1:10)体外释药具有酸敏特性,可将DOX递送至肿瘤细胞线粒体和细胞核,增强了DOX的抗肿瘤活性,可逆转肿瘤耐药,减少了DOX在正常组织的分布,降低了DOX的毒副作用。
【学位单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：R943
【部分图文】：

示意图,路线图,示意图,二氯甲烷

图 1 TPP-DOX 的合成路线图示意图。2.2 棕榈酸-聚乙二醇-叶酸（PA-hyd-PEG-FA）的合成PA-hyd-PEG-FA 的合成路线如图 2 所示，称取 1g（3.91 mmol）PA、0.9g（7.83mmol） NHS、1.5g（7.85 mmol） EDCI 溶于 20mL 二氯甲烷中，室温搅拌 5 h。加入 0.9 g（6.87 mmol） Boc-NH-NH2和 30μL 三乙胺，室温反应 24 h，反应产物PA-NH-NH2-Boc 通过硅胶柱层析纯化（石油醚:乙酸乙酯=1:2）。1g（2.58 mmol）PA-NH-NH2-Boc 加入 5 mL 二氯甲烷中，再加入 2 mL 三氟乙酸，加热回流 2 h，再加入 10 mL 水，用二氯甲烷萃取，有机相通过无水 Na2SO4干燥，真空旋转蒸干得到产物 PA-NH-NH2。称取 1g（2.27 mmol） FA、0.5g（4.38 mmol） NHS、0.9g（4.71 mmol） EDCI溶于 20mL 二甲亚砜（DMSO）中，室温反应 12 h，逐滴加入溶有 4g（1 mmol） PEG的 10mL DMSO 溶液，搅拌，反应 4 h，加入 50 mL 水稀释，过滤得滤液，将滤液转入透析袋，对水进行透析（截流分子量 1000 Da），冻干，得 FA-PEG-NH2。

示意图,路线,示意图,胶束

-28-图 2 PA-hyd-PEG-FA 的合成路线示意图。2.3 DOX/TPP-DOX@PA-hyd-PEG-FA 的制备采用乳化-溶剂挥发法制备载药胶束。将 10 mg FA-PEG-hyd-PA 溶于 20 mL 二氯甲烷中，在剧烈搅拌下滴加溶有 2 mg DOX 和 2 mg TPP-DOX 的 3%PVA 水溶液，继续搅拌使有机溶剂挥发，4 °C 离心（15000 rpm, 15 min），沉淀用蒸馏水洗涤三次，纯水分散得胶束 DOX/TPP-DOX@PA-hyd-PEG-FA 溶液，冻干得固体。2.4 胶束的特性表征2.4.1 DOX/TPP-DOX@PA-hyd-PEG-FA 的粒径及形态称取胶束 5 mg，溶于 5 mL 双蒸水中，用 Zeta 电位及纳米粒度分析仪测定胶束的粒径分布。取一滴滴于载网上，溶剂挥发干后，磷钨酸染色，透射电镜下观察。

高效液相色谱,质谱图,硕士学位论文,高效液相色谱

TPP-DOX的质谱图

【相似文献】