降脂小分子化合物的筛选与作用机制研究

发布时间：2020-09-24 05:32

　　大量的临床研究结果表明,低密度脂蛋白-胆固醇(Low density lipoproteincholesterol,LDL-C)升高是促进心血管疾病CVD(Cardiovascular disease)发生发展的主要风险因素。在目前的临床实践中,降低患者血脂水平,尤其是LDLC的水平是预防动脉粥样硬化,减少心血管事件最为有效的治疗方案。我国拥有着极其丰富的传统中药资源,并且拥有完整的中医药理论体系和数千年的临床应用经验。以传统中药为源头,结合现代药理活性筛选,不仅有利于传统药物的药理活性作用机制的阐明,更有利于天然活性化合物乃至先导化合物的高效、定向发现。本文从药用植物的粗提物着手,利用人肝细胞系HepG2摄取DiI-LDL的体外活性筛选模型,筛选出细胞毒性弱且能够促进细胞脂质吞噬的药物植物粗提物。接着,我们分离提取目标粗提物中的小分子化合物,寻找可能发挥作用的小分子化合物。根据活性化合物的结构类型和对细胞内的LDLR和PCSK9蛋白水平表现出的不同调节作用,我们最终选取2个代表化合物进行了体内外的药效评价和作用机制研究,以期发现作用机制明确、降脂活性良好的小分子化合物,并比较不同结构类型的化合物在降脂作用机制方面的异同。一.体外活性筛选我们利用人肝细胞系HepG2摄取DiI-LDL的体外活性筛选模型,检测了67种药用植物的粗提物促进细胞吞噬DiI-LDL的作用。其中,泽漆和王瓜根的粗提物表现出良好的促进细胞吞噬脂质的作用,同时对于细胞的形态改变影响较弱。于是,我们分离提取并鉴定了泽漆和王瓜根粗提物中的小分子化合物,用同样的体外筛选体系,检测了120个小分子化合物促进细胞吞噬脂质的作用。从中,我们发现了6个活性较好的化合物,并进一步检测了6个化合物对于HepG2细胞中LDLR蛋白和PCSK9蛋白的含量的影响。根据这6个活性化合物的结构类型,以及对HepG2细胞中LDL的受体LDLR(low-density lipoprotein receptor)和PCSK9(proprotein convertase subtilisin/kexin 9)蛋白水平的影响不同,我们最终选取了升高LDLR蛋白水平和降低PCSK9蛋白水平的三萜化合物C4(23,24-二氢葫芦素B,23,24-dihydrocucurbitacin B),和同时升高LDLR和PCSK9蛋白水平的二萜化合物A31(大戟苷L,euphornin L)作为代表性化合物进行后续的动物体内药效评价以及降脂作用机制的研究。二.化合物C4的作用机制研究C4具有抗炎、抗HIV-1(1型艾滋病病毒)等药理活性,但其在脂质代谢方面的调控作用还没有被报道。本文首次在体外和体内的水平上评价了化合物C4的降脂活性,并探索了化合物的降脂作用机制。我们发现在HepG2细胞中,化合物在转录水平、转录后水平和翻译后水平共同调控,升高胞内LDLR蛋白的含量,增加细胞对LDL的吞噬作用。在转录水平上,C4升高成熟形式SREBP2蛋白的水平,增加LDLR mRNA的转录。在转录后水平上,C4稳定LDLR mRNA,延长mRNA的半衰期。在翻译后水平,C4降低细胞核内HNF1α蛋白的水平,减少PCSK9蛋白的表达,降低PCSK9-介导的LDLR蛋白在溶酶体中的降解。在高脂饮食诱导的的高血脂金黄地鼠模型上,以灌胃给药(Intragastric,i.g.)的方式给予C4(30 mg/kg/d)10天以后,给药组金黄地鼠血清中的LDLC、总胆固醇(Total cholesterol,TC)和甘油三酯(Triglyceride,TG)的水平显著降低。给药三周以后,效果更显著。同时,金黄地鼠肝脏组织中LDLR蛋白含量升高,而肝脏组织和血清中的PCSK9蛋白水平显著降低。我们的研究表明,化合物C4具有对LDLR和PCSK9的双重调节作用,为降脂药物开发,尤其是降低PCSK9蛋白表达的小分子调节剂的开发,提供了结构基础。三.化合物A31的降脂作用机制研究假白榄烷型二萜化合物的结构和生物活性多样,已报道的有抗炎和逆转P-糖蛋白(p-gp)介导的多药耐药(multi-drug resistance,MDR)的活性等。目前针对假白榄烷型二萜化合物A31的生物活性研究主要集中在逆转MDR的活性方面。本文首次在体外和体内的水平上评价了化合物A31的降脂活性,并对其作用机制做了初步的探索。在HepG2细胞模型上,我们发现A31通过对LDLR转录后和翻译后水平的调控,增加胞内LDLR蛋白的含量,促进细胞吞噬LDL。在转录后水平,A31增加LDLR mRNA的稳定性,延长LDLR mRNA的半衰期。在翻译后水平,化合物影响PCSK9蛋白的分泌过程,导致胞内PCSK9蛋白含量升高,而分泌到胞外的PCSK9蛋白减少,进而降低PCSK9-介导的LDLR蛋白在溶酶体中的降解。在高血脂金黄地鼠动物模型上,给药三周后(i.g.,30 mg/kg/d),A31显著降低金黄地鼠血清中的TC和LDL-C水平。同时,金黄地鼠肝脏组织中的LDLR和PCSK9蛋白含量升高,而血清中PCSK9蛋白含量显著降低。我们的研究表明,与化合物C4相似,化合物A31同样可以通过对LDLR和PCSK9的双重调控作用增加胞内LDLR蛋白的水平。不同的是,C4还通过转录水平影响LDLR mRNA的转录。此外,两个化合物对PCSK9蛋白的调控方式不同。C4通过影响PCSK9 mRNA的转录,减少PCSK9的蛋白表达;而A31对PCSK9的转录和蛋白表达没有显著影响,主要通过减少PCSK9蛋白的分泌,增加胞内LDLR蛋白的含量。综上,本文利用DiI-LDL吞噬活性体外筛选模型,从药用植物的粗提物着手,筛选具有促进细胞吞噬LDL的目标粗提物。然后从目标粗提物中提取分离小分子化合物,建立小分子化合物库。接着利用同样的体外筛选模型,筛选出具有促进细胞吞噬LDL的活性小分子化合物。最终选取两个化合物作为两种结构类型的代表,进一步在体内评价了两种化合物的药效活性,并深入研究了两个化合物的降脂作用机制,展示了两种不同的LDLR和PCSK9的双重调控策略。
【学位单位】：中国科学院大学(中国科学院上海药物研究所)
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R914
【部分图文】：

网格蛋白,肝脏,小泡,组织细胞

图 1.1 PCSK9 蛋白的突变位点[31]Figure 1.1 The mutations in PCSK9 protein2.3.2 PCSK9 的功能循环中的 LDL 主要由各组织细胞中细胞表面的 LDL 受体（LDLR, LDLreceptor）摄取并内吞进入细胞进行代谢[34]。其中肝脏是其主要的代谢场所，大约 80%的 LDL 由肝脏清除[34]。LDLR 通过配体结合区域识别并结合 LDL 中的ApoB，形成 LDLR-LDL 复合体。LDLR-LDL 复合体在内吞接头蛋白 ARH（autosomal recessive hypercholesterolemia）等组成的网格蛋白（clathrin）复合体的介导下内吞进入细胞内。随着网格蛋白复合体迅的解体，网格蛋白包裹下的内吞小泡相互融合，形成内吞体（endosome）[35]。随着内吞体中 pH 的降低，LDL 与 LDLR 解离，LDL 在溶酶体中被降解，LDLR 则回到细胞膜表面进

功能图,功能,他汀,单抗

图 1.2 PCSK9 的功能[44]Figure 1.2 The function of PCSK9 protein2.3.3 PCSK9 单克隆抗体2015 年，PCSK9 的两个人源化的单抗，Alirocumab（Regeneron 公司与Sanofi 公司）和 Evolocumab（Amgen 公司），被 FDA（Food and DrugAdministration）先后批准。临床 II 期和 III 期研究结果表明，两个单抗可降低约 60%的 LDL-C 水平，降低约 50%的心血管事件[43, 45]。且与他汀单独用药相比，单抗与他汀的联用可进步降低动脉粥样硬化性心血管疾病（atherosclerotic cardiovascular disease, ASCVD ）的风险，显著地降低心血管事件的死亡率[42, 43, 46]。1) 他汀联合 PCSK9 单抗

二级预防,患者,方案,他汀

降脂小分子化合物的筛选与作用机制研究此外，指南中除了推荐杂合性高胆固醇血症患者使用 PCSK9 单抗作为级预防（primary prevention）以外，其他 ASCVD 患者应首要考虑使用依折麦布与他汀联合用药，其次考虑 PCSK9 单抗与他汀联合用药（详见图 1.3）[52]。在我国，新的家族性高胆固醇血症的治疗方案（2018 年）也遵循这原则[53]。（详见图 1.4）

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