NT157与强心苷类药物10-4-4抗肝癌作用及分子机制研究

发布时间：2020-09-25 17:13

　　肝癌作为严重威胁人类健康的凶手之一,其治愈率很难达到理想预期的主要原因在于:治疗肿瘤的方法单一;长期用药后肿瘤产生明显的耐药性。本论文利用不同方法研究两个具有抗肝癌作用的小分子化合物:NT157和强心苷10-4-4的抗肿瘤机制,对发现新的高效抑癌药物、研究药物的抑瘤机制,乃至开发新药以及治疗癌症意义重大。第一章研究NT157的抗肝癌分子机制。肝癌是一种在我国发生率较高的一种恶性肿瘤,多种生理或环境因素都可能诱发肝癌,因此明确治疗肝癌药物的作用靶点和机制就显得尤为重要。NT157是小分子酪氨酸磷酸化抑制剂在细胞水平对多种癌细胞(结肠癌、前列腺癌等)有较强的抑制效果。我们的实验发现NT157在肝癌细胞中也具有较强的促凋亡作用,但是NT157在肝癌细胞中的作用机制还未被研究。我们利用蛋白质组学技术在蛋白水平对NT157抑制肝癌细胞生长或诱导癌细胞凋亡机制进行探索。利用细胞培养中氨基酸稳定同位素标记(Stable isotope labeling with amino acids in cell culture,SILAC)定量蛋白质组学技术,研究NT157在肝癌细胞中引起的蛋白质的变化。结果表明NT157在诱导肝癌细胞凋亡作用中有5273个蛋白质的变化,我们通过对这些蛋白的分类,帮助我们发现了 NT157在肝癌细胞中的新机制,能为该类多靶点抗肿瘤药的研发提供帮助。第二章研究强心苷类药物10-4-4靶向核受体Nur77的抗肝癌作用。传统的强心苷主要用于治疗包括心律不齐、慢性心功能不全等在内的各种心脏类疾病,近些年来强心苷的抑制肿瘤作用逐渐被发现并引起了药物学家的重视,但是传统强心苷毒性较大,不良反应众多,不适于临床癌症的治疗。这些不良反应出现的原因主要在于强心苷分子机制还未被完全了解。我们前期筛选了一系列强心苷衍生物,发现化合物10-4-4具有较强的抗肿瘤作用。对10-4-4的研究发现,它能够诱导核受体Nur77的蛋白表达,依赖Nur77的表达诱导肿瘤细胞凋亡和抑制细胞周期。对强心苷类药物分子机制的探究,能够在以后的研发过程中指导这一系列药物的研发,提高疗效的同时,减轻副作用。
【学位单位】：厦门大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R965
【部分图文】：

蛋白质组学,质谱分析,药物发现

Ｆｉｇｕｒｅ邋３：邋Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ邋Ｍａｓｓ邋Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ邋（ＭＳ）－ｂａｓｅｄ邋ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ邋ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ逡逑摘自：Ｒｕｅｄｉ邋Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ，Ｍａｔｔｈｉａｓ邋Ｍａｎｎ．Ｍａｓｓ邋ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ－ｂａｓｅｄ邋ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２００３，１邋（５）：２５２－２６２．逡逑３．２蛋白质组学在药物研究中的应用逡逑药物发现是一个漫长的过程，它使用来自不同领域的各种工具。为了加速这逡逑一进程，已经开发出许多生物技术，包括基因组学，蛋白质组学和一些细胞和有逡逑机方法学［２９］。蛋白质组学的发展面临跨学科的挑战，包括传统（生物和化学）和逡逑新兴（高通量自动化和生物信息学）。新兴技术包括二维凝胶电泳，质谱，蛋白逡逑质阵列，同位素编码，双杂交系统，信息技术和基于活性的分析。作为蛋白质组逡逑学技术的一部分，这些技术正在推进蛋白质组学在药物发现过程中的实用性？。逡逑药物发现过程涉及许多阶段，包括目标识别，信号通路识别，小分子优化以逡逑６逡逑

凋亡,肝癌细胞,细胞

但其对肝癌的作用尚无报道，为明确ＮＴ１５７是否对肝癌细胞具有抑制作逡逑用，我们对ＳＫ－Ｈｅｐ－丨肝癌细胞进行ＭＴＴ实验，实验结果表明ＮＴ１５７对ＳＫ－Ｈｅｐ－１逡逑肝癌细胞的增殖产生了明显的抑制作用，其ＩＣ５０为６．７６＾Ｍ邋（图４Ａ）。为了进逡逑一步说明ＮＴ１５７对肝癌细胞的抑制作用是否是通过诱导细胞凋亡实现的，我们逡逑在不同的药物作用浓度和时间下观察ＰＡＲＰ蛋白的切割情况。研究表明ＮＴ１５７逡逑处理ＳＫ－Ｈｅｐ－１肝癌细胞６小鼠就出现了明显的ＰＡＲＰ切割，同时我们发现印Ｍ逡逑的药物浓度处理也出现了邋ＰＡＲＰ切割，这一方面说明ＭＴＴ的结果可信，也说明逡逑ＮＴ丨５７对细胞的凋亡作用有时间浓度依赖性（图４Ｂ）。为了进一步说明ＮＴ１５７逡逑的诱导凋亡作用，我们采用了邋ＤＡＰＩ染色显示处理ＳＫ－Ｈｅｐ－１细胞，６小时后约逡逑６０．０％的细胞显示出核冷凝和碎裂（图５Ａ）。此外，细胞用ＡｎｎｅｘｉｎＶ／ＰＩ染色逡逑后，经流式细胞仪分析显示，２ｐＭＮＴ１５７处理细胞６小时，ＳＫ－Ｈｅｐ－１细胞发生逡逑广泛的中晚期凋亡

核膜,细胞,凋亡,显示处理

ＮＴ丨５７对细胞的凋亡作用有时间浓度依赖性（图４Ｂ）。为了进一步说明ＮＴ１５７逡逑的诱导凋亡作用，我们采用了邋ＤＡＰＩ染色显示处理ＳＫ－Ｈｅｐ－１细胞，６小时后约逡逑６０．０％的细胞显示出核冷凝和碎裂（图５Ａ）。此外，细胞用ＡｎｎｅｘｉｎＶ／ＰＩ染色逡逑后，经流式细胞仪分析显示，２ｐＭＮＴ１５７处理细胞６小时，ＳＫ－Ｈｅｐ－１细胞发生逡逑广泛的中晚期凋亡，从０．５９％增加到１３％（图５Ｂ）。逡逑Ａ邋１０0Ｌ逦１０５０＝６．７６０＾１逦Ｂ逡逑＾８０－ＮＴ１５７（１０ｈ）逦ＮＴ１５７（６｜ｉＭ）逡逑０邋２邋４邋６邋８邋１０＿逦０邋２邋４邋６邋８邋（ｈ）逡逑ｍＭＭＭｍ逡逑＾逦＼逦ＰＡＲＰ逦ＰＡＲＰ逡逑ｆ＇逦＼逦…逦逦逡逑２邋２０＊逦ｆ－ａｃｔｉｎ邋？＾丯邋Ｐ－ａｃｔｉｎ邋■邋■邋？邋广逡逑２．５逦３．０逦３．５逦４．０逦４５逡逑ＬＯＧＩＯＣ逡逑图４：邋ＮＴ１５７诱导肝癌细胞ＳＫ－ＨＥＰ－ｌ凋亡。Ａ：ＭＴＴ实验检测ＮＴ１５７对ＳＫ－ＨＥＰ－ｌ逡逑的抑制增殖作用，其对细胞的ＩＣ５０为６．７６ｎＭ。Ｂ：使用时间梯度２、４、６、８、１０ｈ，浓度梯逡逑度２、４、６、８、１０ｐＭ分别对细胞进行处理，蛋白免疫印迹法测定ＮＴ１５７处理后的细胞中逡逑ＰＡＲＰ剪切蛋闩的表达水平。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋４：邋ＮＴ１５７邋ｉｎｄｕｃｅｓ邋ａｐｏｐｔｏｓｉｓ邋ｏｆ邋ｈｅｐａｔｏｍａ邋ｃｅｌｌｓ邋ＳＫ－ＨＥＰ－ｌ．邋Ａ：邋ＭＴＴ邋ａｓｓａｙ逡逑ｄｅｔｅｃｔｓ邋ｔｈｅ邋ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ邋ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ＮＴ邋１５７邋ｏｎ邋ＳＫ－ＨＥＰ－ｌ

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