基于恰塔努加链霉菌的聚酮类底盘细胞构建与评估

发布时间：2020-09-25 18:25

　　 链霉菌是微生物药物主要生产菌,富含各类药物合成元件和合成前体,具备完整的抗性/耐药机制,是药物异源合成的优良底盘;其富含次级代谢基因簇,是天然活性产物的宝库。基于工业菌构建链霉菌底盘细胞,创建人工合成体系,有望创新遗传育种技术,从“一菌一药、产物多组分”变革为“一底盘多药、单一组分”的新模式,服务于新颖天然产物挖掘和微生物药物优质高产,是微生物制药领域的重要创新。恰塔努加链霉菌L10(Streptomyce schattanoogensis L10)是生产纳他霉素(natamycin,PKS)的工业菌(产量高达16g/L),基因组为9Mb,含32个次级代谢生物合成基因簇,大部分是聚酮类。恰塔努加链霉菌L10中酰基供体丰富,具有高效调控网络,遗传稳定性强、遗传操作简单,有望开发为高效的聚酮类底盘细胞。本课题基于比较基因组学、泛基因组学及功能基因组学技术,建立了系统分析链霉菌基因组中必需基因和冗余基因的方法。通过antiSMASH、IslandViewer4、ISsaga2对L10的基因组进行分析,定位了冗余基因元件如次级代谢生物合成基因簇(BGCs)、基因组岛(GIs)、可移动元件(MGEs)的分布,表明冗余基因元件主要分布在染色体末端(60%的次级代谢基因簇、73.5%的基因组岛、74%的插入序列);通过全基因组比对和泛基因组分析,将L10基因组明确划分为高度保守的核心基因区(6.0Mb)和两个亚端粒区(左右分别为2.0Mb和1.0Mb)两部分;通过全蛋白质组多重比对分析(OrthoVenn)和KEGG代谢通路分析,表明L10基因组中约有2700个必需基因,绝大部分与细胞基本构架、初级代谢(如糖代谢、TCA循环、氨基酸代谢)、DNA功能(复制、转录、翻译)、细胞分裂等基本生命活动相关,其余的约5500个基因则主要是与次级代谢途径相关基因、致病性相关基因、可移动元件及噬菌体相关基因;综合必需基因、冗余基因的功能及分布,准确界定了两个大片段的冗余基因区域(1.3Mb和0.7Mb),为理性设计工业链霉菌底盘细胞提供了依据。课题优化了Cre/loxP位点特异性重组系统,用于大规模删减冗余基因区,构建了链霉菌简约基因组。基于链霉菌通用载体pSET152和pKC1139构建了 一系列链霉菌中通用的loxP或loxP突变位点快速整合载体,可广泛应用到其它链霉菌中。鉴于硫链丝菌素诱导型启动子tipAp的本底表达高、硫链丝菌素对大部分链霉菌的毒性,优化了 Cre酶诱导表达质粒pALCre,用己内酰胺诱导型启动子nitAp替换了tipAp构建了 pNitCre,只需用0.1%的ε-己内酰胺便可诱导Cre酶的高效严谨表达,且己内酰胺对绝大部分链霉菌不具有毒性,因此,也可广泛应用到其它链霉菌中。利用上述技术,我们实现了 L10中两个大片段冗余基因区域的高效缺失,构建了两个基因组简化的恰塔努加链霉菌底盘细胞(L320和L321)。同时,完善了基因簇捕获技术,实现了 3个基因簇的直接克隆或组装,推动了链霉菌合成生物学使能技术的发展。同时,本课题对恰塔努加链霉菌底盘细胞L321进行了系统的评估。与L10相比,L321展现出遗传稳定性增强、转化效率提高、次级代谢谱简化、异源蛋白和次级代谢产物表达能力增强、胞内能量(ATP)和还原力(NADPH/NADP+)水平提高等优良性能,且底盘细胞L321菌丝比较分散,不会在发酵过程中形成沉淀,有利于工业化生产。以L321为基础,通过进一步遗传改造,阻断了主要副产物-氧化偶氮霉素的生物合成途径,获得了次级代谢谱更加简化的底盘L325,最终表明L321和L325适合于聚酮类次级代谢产物异源合成,具有潜在的工业应用价值。
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R915
【部分图文】：

浙江大学博士学位论文逦第一章绪论逡逑缺失的大肠杆菌突变株（ＣＤＡ３４５６），共计缺失了邋３１３ｋｂ邋（图１－１），但该敲除系统逡逑有一个缺点：基因组片段缺失以后会残留一段序列，这些残留的选择标记序列或逡逑者位点特异性重组酶识别位点（／ｏｘ尸或需要从缺失突变株基因组中删除［６１］。逡逑Ｋｍ＂邋ｋ逦Ｃｍ邋＿邋＾逡逑ＶＥ逦°＼ｒ逦ＶＥ逡逑ＦＰ－ｌｆｌ邋ｐＴｎＫｌｏｘＰ邋ｐＲＰ－１逦ＦＰ－ＭＩ邋ｐＴｎＣｌｏｘＰ邋ＵＲＰ－１逡逑Ｌ邋（３．４邋ｋｂ）邋Ｊ逦Ｌ邋（３．５邋ｋｂ）邋Ｉ逡逑．ｍＸ＾＾逦ａｍ／Ｓ—逡逑１邋ＰＣＲ邋ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋｜逡逑

较小基因组为合成生物学提供了一个平台基因组，在该平台基因组中细胞代逡逑谢产物和能量被有效的利用，直接合成目标代谢产物，而且在底盘基因组中代谢逡逑副产物可以降到最低，目标产物的质量和稳定性达到最高（图１－４）。较小基因组逡逑９逡逑

种：一种是交换后恢复到野生型，另一种是产生靶基因缺失的突变株。通过大量逡逑筛选，可以筛选到靶基因缺失的突变株，用于后续基因功能研究。利用同源重组逡逑技术进行链霉菌基因组编辑的策略（以质粒ＰＫＣ１１３９为例）如图１－５：逡逑逦ｒ邋＂＂—＂—ｍ逦逡逑＾逦逦逡逑１１逦ＰＫＣ１Ｉ３９逡逑Ｘ逦Ｊ逡逑Ｓｉｎｇｌｅ邋Ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ逡逑ａｏｃＯＨＶ邋／？ＳＣ５邋ｏｎ邋ｏｒｉＴ￣ｉｒａＪ逡逑￣顿，逦Ｉ．．．．．逦１，１邋邋逡逑Ａ逦Ｂ逦Ｃ逦Ｄ逡逑Ｄｏｕｂｌｅ邋Ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ逡逑野生型逡逑ｊ逦＾邋■邋■邋＇邋＇邋？邋＾邋■邋■逦■邋？邋．．—－．逡逑－ｆ－邋Ａ／Ｃ邋Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ邋ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ逡逑逦邋二逦逦突变株逡逑Ｂ／Ｄ邋Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ邋ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ逡逑图１－５基于同源重组的基因敲除逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－５邋Ｇｅｎｅ邋ｄｅｌｅｔｉｏｎ邋ｂｙ邋ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ邋ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ逡逑此外，ｐＫＣ１１３９质粒中含有链霉菌温敏型复制子／＾Ｇ５，在３４°Ｃ以上，该质粒逡逑会丢失，可以在温度及抗生素选择压力下促进质粒与基因姐间的同源重组，提高逡逑筛选效率。而自杀质粒则不含有链霉菌的复制子，因而不能在链霉菌体内复制，逡逑质粒通过接合转移进入链霉菌体内后

本文编号：2826901