铁蛋白-海藻酸钠包埋ACE抑制肽及细胞吸收机制的研究

发布时间：2020-09-26 17:30

　　 本文以马脾脱铁蛋白(Horse spleen apoferritin,HSF)和海藻酸钠(Sodium alginate,SA)作为纳米包埋载体,利用铁蛋白在极酸条件下可逆组装特性和海藻酸钠的控释作用,包埋血管紧张素转化酶(Angiotensin converting enzyme,ACE)抑制肽丙氨酸-组氨酸-亮氨酸-亮氨酸(Ala-His-Leu-Leu,AHLL),以期提高ACE抑制肽AHLL在消化系统中的吸收效果。以包封率为评价指标,优化实验条件。使用纳米粒径仪和透射电子显微镜观察纳米粒表征,运用光谱扫描比较包埋处理后蛋白质结构变化,研究紫外辐射、温度及pH值对纳米粒稳定性的影响。在模拟体外消化对AHLL纳米粒吸收效果后,建立并验证Caco-2细胞单层模型,运用该模型进行HSF-AHLL肠吸收机制研究。本文得出的主要结论如下:(1)制备纳米粒的最优条件是:载体铁蛋白浓度在1~2μM之间,多糖浓度10mg/L,AHLL的终浓度在100~200μg/mL范围内,可制备出包封率较高的纳米粒体系。通过粒径和电位测定,AHLL极有可能被包埋进HSF空腔中,且经过透射扫描电镜对其表征,表观上说明HSF-AHLL和HSF-SA-AHLL形成了稳定的纳米体系。(2)紫外光谱说明AHLL纳米粒具有与HSF类似的大分子共轭结构;荧光光谱说明AHLL纳米粒只是改变了铁蛋白在四重轴通道上的色氨酸微环境;从圆二色谱中可知:经过包埋处理后蛋白质的α-螺旋结构和β-转角结构含量显著减少,而β-折叠结构含量增加,说明包埋后的蛋白空间结构发生一定的变化,从而使蛋白质更加展开。紫外光照24 h后,HSF-AHLL和HSF-SA-AHLL的降解率比单独的AHLL分别降低了35.83%和43.86%;不同温度处理60 min,80℃处降解率分别降低了26.96%和38.51%,说明HSF-AHLL和HSF-SA-AHLL较游离的AHLL光照和热稳定性显著提高。pH值对纳米粒稳定性的影响说明,中性环境下HSF-AHLL纳米粒的稳定性最好。DSC实验说明:包埋处理后的铁蛋白结构更加展开,与AHLL氢键的相互作用加强,纳米粒的热稳定性更好。体外模拟胃肠道系统发现,由于在胃道的极酸性环境下HSF亚基会打开,HSF-AHLL相比AHLL单独进入消化系统,整体上看并没有提高ACE抑制活性;而HSF-SA-AHLL进入胃道后,SA的缓释保护作用使得AHLL不被胃蛋白酶酶解,同时HSF-AHLL顺利进入肠道,在肠道的中性条件下稳定性较好,从而有效吸收,ACE抑制活性显著提高。(3)本实验室建立的Caco-2细胞模型结果为:Caco-2细胞生长周期约为7~9 d,生长较为缓慢,传代的时间控制在4~5 d之间,消化时间控制在3~5 min之间;培养4~5 d,通过倒置显微镜观察Caco-2细胞形成致密的单层结构。培养16 d后Caco-2细胞会分化成形态上与小肠上皮细胞相似的单层模型,肠腔侧分化形成微绒毛与细胞间形成了完整的致密结构。其单层模型的跨膜电阻值基本保持在650?·cm~2左右,Caco-2细胞单层肠腔侧的碱性磷酸酶活性是基底侧的碱性磷酸酶活性的17.71倍,说明出现了明显的极化现象;荧光黄AP→BL侧的转运实验,其渗透系数也低于转运实验规定的1.0×10~(-6)cm/s。(4)运用验证过的Caco-2细胞模型研究HSF-AHLL纳米粒的细胞肠吸收机制结果为:通过MTT试验选择浓度为100~200μg/mL的HSF-AHLL进行细胞转运实验。同一时间内,HSF-AHLL纳米粒明显比单独的AHLL在Caco-2细胞单层模型上转运量大,且表观渗透系数(第120 min)也明显高于后者。HSF-AHLL的双向转运均对时间有明显的依懒性,且主动运输和被动运输同时存在。HSF-AHLL在AP→BL方向转运的表观渗透系数为26.97×10~(-6)cm/s,而BL→AP方向的为5.79×10~(-6)cm/s,AP侧到BL侧的转运速率远大于反向转运速率,说明HSF-AHLL在Caco-2细胞单层吸收过程中吸收作用大于外排作用且具有一定方向性。HSF-AHLL在Caco-2细胞模型中的转运与温度和pH值都有关,且对样品浓度有依赖性。在HSF-AHLL纳米粒中AHLL终浓度为100μg/mL,供液pH值为7.4,温度为37℃条件下,其转运渗透系数最高。加入外排作用的蛋白抑制剂的结果表明,AHLL是P-糖蛋白的外排底物且其外排主要是由MRP2转运蛋白介导的。内吞抑制剂和肽载体抑制剂对AHLL的转运没有显著影响,而脱氧胆酸钠能显著促进其转运,证明AHLL主要是通过细胞旁路转运穿过小肠上皮细胞的。而这两种抑制剂和脱氧胆酸钠对HSF-AHLL的转运吸收没有显著促进作用,可能其是通过其他载体介导转运的。
【学位单位】：浙江海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R943
【部分图文】：

图 1-2 铁蛋白空间结构示意图Fig 1.2 Schematic diagram of ferritin spatial structure1.2.3 铁蛋白的功能铁蛋白在生物体内扮演着重要角色，其调节体内铁平衡是通过储存和释放铁离子的方式。当机体察觉 Fe2+浓度过高时，Fention 反应启动，产生自由基[47]。羟基自由基由于其超强的氧化能力剧烈反应，使细胞成分改变，并损失细胞完整性而使心脏、肝脏、肾脏等机体组织受损，促使患癌的风险大大增加。尤其是，脑部沉积了过量的铁，会造成中枢神经系统受到伤害，易患上帕金森和阿尔茨海默症等疾病。而铁蛋白通过氧化、移动、矿质铁心的形成和生长（去毒反应）[48]，而将体内多余的Ｆe2+贮存在铁蛋白内部，来保护机体免受损伤[49]。因此，铁蛋白的双重功能维持着铁元素在体内的动态平衡。研究得出，植物铁蛋白中的 EP 肽段与铁离子的氧化沉淀及释放活性有关。豌豆铁蛋白（PSF）在铁浓度很高时，其中的 EP 会使 Fe2+氧化沉淀；同时 EP 片段特有的酶活，使铁蛋白发生自降解，这一过程中铁离子会快速释放出来，这样种子生长需求

第二章 ACE 抑制肽 AHLL 纳米粒的制备果与分析HLL 含量分析方法的建立标准曲线实验的色谱条件下，AHLL 的保留时间为 8.97 min（图 2-2）。精E 活性肽 AHLL，用 HBSS 平衡盐溶液配制浓度为 20 mg/mL 的一系列浓度标样（5、10、50、100、200μg/mL）。以峰面积对质出在空白HBSS中AHLL的标准曲线为y=5.14466x+2.2248（3R2μg/mL 范围内线性关系良好。

4-1 不同时间段 Caco-2 细胞生长曲线图rowth curve of Caco-2 monolayers at differen层的形态学观察养瓶中的 Caco-2 细胞，细胞在瓶中贴的融合，形成单层结构，显微镜下可清胞间连接紧密，形态呈 铺路石 状3 6 9 12 15 18 21 时间/d

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本文编号：2827269