液态药物载药法制备10-羟基喜树碱白蛋白纳米粒以及其初步体内外评价

发布时间：2020-09-26 18:58

　　背景:白蛋白纳米给药系统(Albumin nano drug delivery system,ANPs-DDS)是以白蛋白为基质材料制备的纳米制剂,具有很多优良的特性。例如一类材料人血白蛋白(Huma serum albumin,HSA),其属于内源性物质,其具有无毒、无免疫源性、生物可降解和生物相容性高的特点。同时在体内很多药物都具有与血浆蛋白结合的能力,因此白蛋白为天然的理想药物载体。结合日趋受到关注的纳米给药(Nano drug delivery system,NDDS)系统的发展,制备以人血白蛋白为基质的纳米粒(Huma serum albumin nanoparticles,HSA-NPs)以及给药系统已受到多方重视。随着American Bioscience的专利产品人血白蛋白纳米粒紫杉醇制剂Abraxane#174;的上市,白蛋白纳米制剂已成为新型纳米制剂的代表,具有巨大的市场潜力。喜树碱(camptothecin,CPT)类药物是天然植物喜树科当中提取的具有抗癌活性的化学成分,其主要靶向抑制癌细胞核当中的拓扑异构酶-I[1]。防止癌细胞的拓扑异构酶-I对癌细胞DNA单链异构的作用,阻碍DNA的复制与合成,从而达到抑制癌细胞生长的作用。10-羟基喜树碱(10-hydroxycamptothecin,HCPT)是喜树碱的10位羟基衍生物,较CPT而言,针对临床上的胃癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌和卵巢癌具有较好的抗癌活性[2]。但由于喜树碱类药物本身的理化性质不理想,不溶于水,在生理及碱性条件下易由高治疗活性的内酯环开环形成高毒性而低治疗作用的羧酸形式[3,4]。因此传统的注射液(p H值为10的液体注射液)并没有较好的临床疗效。进而影响了该药物的广泛应用。通过新型纳米药物制剂技术的发展,这一问题逐步得到解决,其中发展了纳米晶体、脂质体、微乳等剂型。人血白蛋白纳米制剂也同样得到重视,目前虽然大量的文献已报道HCPT类药物的白蛋白纳米制剂,但由于羟基喜树碱在二氯甲烷、氯仿和豆油等有机相中溶解度不高,并不适用于现有广泛应用的乳化法和Nab-technology载药法。现有方法存在载药效率低、毒性试剂的引入(有机相和毒性交联剂等)等问题,因此该药物制备成为白蛋白载药纳米粒仍存在技术壁垒[5]。目的:为克服载药效率低和毒性试剂引入等问题以及探索创新型载药方式。本研究开展了以内源性还原态谷胱甘肽(Reduced-glutathione,r-GSH)为交联剂制备的空白HSA-NPs并结合低分子量聚乙二醇(Low weight polyethylene glycol,l-PEG)HCPT复合物载药法首次实现干燥条件下载药的研究,具有一定的创新性。该方法通过l-PEG与目标分子HCPT形成广泛的氢键作用,进而提高该药物在其中的溶解度,形成高含量的HCPT液态药物复合物,结合该复合物的特殊性质开展载药研究。方法:为成功制备以人血白蛋白为载体的10-羟基喜树碱纳米粒(HCPT-HSA-NPs),本课题首先针对r-GSH制备空白HSA-NPs并进行条件优化和探索。对蛋白液浓度、乙醇比例和制备流程进行优化,成功制备粒径小于200nm,性质稳定的空白HSA-NPs。接下来本研究针对l-PEG与HCPT复合物制备的参数进行考察和研究,得到稳定的l-PEG-HCPT,该复合物具有较高的HCPT浓度(80mg/ml)并具有遇水极易析出的特性。进而开展l-PEG-HCPT复合物在干燥条件下与HSA-NPs冻干粉末混合载药工艺的初步研究,得出基本载药步骤:(1)经凝聚法制备以还原性谷胱甘肽为交联剂的HSA-NPs,并进行冻干处理。(2)利用乙醇为溶媒将HCPT与l-PEG在低压旋转蒸发条件下制备l-PEG-HCP。(3)在干燥条件下将HSA-NPs冻干粉末与液态药物复l-PEG-HCP进行充分搅拌、挤压混合。(4)再将该混合物重新分散至水环境中得到较理想的HCPT-HSA-NPs。对制备得到的样品进行体内、体外表征评价,深入阐述和解释该载药方法的机理和可行性。通过体外表征的项目如:粒径、分布、Zeta电位、含量、复合物性质考察、形态观察、释放速率测定、稳定性考察、溶液物理稳定性考察、X-ray粉末衍射(X-ray powder diffraction,XRD)示差扫描量热法(Differential scanning calorimetry,DSC)等方法证明HCPT与HSA-NPs结合的方式以及载药原理。并通过体外细胞毒性实验和体内药效学实验、体内分布实验进一步对比HCPT-HSA-NPs与传统HCPT注射液的体内、外行为,以证明该制备方法的可行性。结果:结果证明制备的HCPT-HSA-NPs符合纳米制剂的形态学和体积要求,经液态药物复合物法制备的纳米粒具有高包封率(Entrapment efficiency,EE)(平均高于99%),平均粒径低于200nm,含量可达7%;制备过程引入试剂毒性较小(乙醇、谷胱甘肽、低分子量聚乙二醇);多分散系数(Polydispersity index,PDI)结果证明该纳米制剂分布较窄。Zeta电位符合溶液稳定性要求。该HCPT-HSA-NPs具有体外缓释作用,释放周期达100小时。溶液物理稳定性实验提供了载药机制的可行性的证据并证明了HSA-NPs的载体功能。同时XRD和DSC结果证明l-PEG-HCPT可以成功的将HCPT递送到HSA-NPs的空间网状结构中。各结果系统的证明了利用液态HCPT复合物载药法依据l-PEG-HCPT高含量和遇水极易析出的性质所制定的载药策略的可行性。同时制备得到的HCPT-HSA-NPs在细胞毒试验、异种瘤移植抑制实验和药物体内分布等体内实验中得到印证。体内体外结果表明该方法可以成功将HCPT包载到人血白蛋白纳米上并在体内发挥作用,细胞毒性实验证明HCPT-HSA-NPs较HCPT注射剂具有显著提升,体内抑瘤效果显著高于传统注射制剂(传统注射剂为21.45%,HCPT-HSA-NPs为40.63%,p0.01)等优势。结论:同时与现有HCPT白蛋白纳米粒制备方便相比较,具有一定的优势。其相对于传统的乳化法、p H调节沉淀法等具有较低的毒性试剂引入、较高的包封率以及较少的投料比例。同时该方法为解决类似HCPT理化性质的白蛋白纳米粒药物包载提供一些思路和拓展方向。
【学位单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：R943
【部分图文】：

死亡率,癌症,恶性肿瘤,发展趋势

言症发展趋势名恶性肿瘤，是机体在各种致癌因素作用下细胞不受调控的增血管疾病成为世界第一大死因，严重威胁人类的生命和生活质量，2008 年全球新发癌症病例 1270 万，死亡人数高达 760 万，比死亡人数总和还多。根据世界卫生组织 2014 年 2 月 3 日发表的中国癌症疾病状况及发展趋势不容乐观。报告称 2012 年中国新。中国新增和死亡病例居于世界第一，发病率低于发达国家。其部位的 4 种恶性肿瘤中，中国新增病例和死亡人数均居世界首位癌症，每分钟 6 人被确诊癌症，每 7、8 人中就有 1 人死于癌症年报》显示近 20 年癌症呈现“三化二线”趋势即：发达化、年轻亡率高。

羟基喜树碱,内酯,结构式

从而达到保护有效结构，提高疗效，同时非常适用于目前实体瘤癌症的治疗。因此如纳米晶复合物等纳米制剂被广泛研究[10,11]。由于白蛋白白为基质的 HCPT 纳米颗粒虽然有文献报道，但10-hydroxycamptothecin-HCPT）理化性质)-4- 乙基 -4,9- 二羟基 -1H- 吡喃并 [3’,4’:6,7] 吲嗪 364.35，C20H16N2O5，CAS：19685-09-7，熔点 2状结晶，无气味。极难溶于水（内酯式, <1μg/ml）），豆油中溶解度为 38μg。遇光易变质，有微吸[6]当 pH 高于 4 时，逐渐由图 1-2 所示的内酯结构随着羧酸式结构的增加而随之增高，因此在稀碱中

羟基喜树碱,羧酸,结构式,药物

统（Nano drug delivery system NDDS），药物递送系或药物自身形成纳米粒子，通过利用其纳米特性和对病灶部位的高浓度富集以及降低其他非靶向器官-1000nm 的粒子，并不是严格的限制在某一粒径范米尺度载体上，可以特定的改变药物在体内释放、分改造实现组织及细胞专一性的摄入，实现药物在靶织）中的特异性结合或者蓄积，在增加药物的治疗的毒副作用，提高给药时病人的顺应性。纳米药物发挥提供一崭新途径。图 1-3 10-羟基喜树碱结构式（羧酸） Structure of 10-hydroxycamptothecin（Carboxylate f

【参考文献】