基于药物—药物偶联体的自组装纳米粒的构建及应用研究

发布时间：2020-09-28 20:13

　　纳米技术可广泛用于癌症治疗。然而,传统纳米药物以载体为主要构建基础,载体多样且复杂,导致纳米药物的载药量低,制备复杂,缺乏重复性和可控性,难以实现大规模生产和临床转化。自组装纳米药物以药物为构建单元,利用药物自身的组装特性,可极大地降低载体的使用量,提高药物的包封率和载药量,避免载体所带来的免疫原性和毒性等安全隐忧,制备简单,可控性高、稳定性好,有望推进纳米药物的大规模生产和临床转化。据此,我们以阿霉素(doxorubicin,DOX)和顺铂(cisplatin,Pt)为模型药物,构建了两种自组装纳米药物递送系统,以提高治疗效果并降低毒副作用,同时避免传统纳米药物递送系统的不足之处。针对DOX的副作用,我们利用小分子药物二氯乙酸(dichloroacetic acid,DCA)合成DOX-DCA偶联体,促进DOX自组装性能;针对Pt的耐药现象和不良反应,我们联合化疗增强剂和耐药抑制剂阿杜丁(adjudin,ADD),合成一系列两亲性的药物-药物偶联体,包括ADD单取代的、具有不同碳链长度的Pt(IV)前药:C_2-Pt-ADD、C_4-Pt-ADD、C_6-Pt-ADD、C_8-Pt-ADD、C_(12)-Pt-ADD和ADD双取代的Pt(IV)前药Pt-2ADD,探索ADD取代度和碳链长度这两种因素对药物自组装性能和肿瘤杀伤能力的影响。通过~1H NMR、~(13)C NMR、MS或HPLC等多种手段验证所合成各化合物的结构和纯度;评价两类药物-药物偶联体的自组装性能,分析其自组装能力的强弱;测定并观察各自组装纳米粒的粒径、电位、形貌、稳定性以及药物的包封率和载药量等;对两类自组装纳米粒进行体外细胞实验评价,包括摄取情况、胞内药动学、体外杀伤或者凋亡情况等;探索两类自组装纳米粒(nanoparticles,NPs)的体外抑瘤情况;同时针对DOX-DCA NPs还开展了药物分布研究和体内安全性评价。结果显示,两种药物-药物偶联体:DOX-DCA和Pt(IV)-ADD(C_2-Pt-ADD、C_4-Pt-ADD、C_6-Pt-ADD、C_8-Pt-ADD、C_(12)-Pt-ADD和Pt-2ADD)均成功合成,药物的纯度均大于98%,并可自组装形成纳米结构。DOX-DCA NPs的粒径为55.8 nm,电位为-28.6±1.1 mV,电镜下呈均一、分散的球形。制备简单、方便,载药量高达71.8±1.7%。经B16F10小鼠黑色素瘤细胞摄取后,DOX-DCA NPs可慢慢聚集到细胞核,发挥抗肿瘤效果。同时在胞内酸性或酯酶存在的条件下,部分DOX-DCA可慢慢裂解生成DOX。相比于游离DOX,DOX-DCA NPs的体外抗肿瘤效果略差,这可能与其摄取和降解较慢等相关。此外,染料DIR标记的DOX-DCA NPs的肿瘤靶向性好,其肿瘤局部的药物分布是游离染料DIR的39.4~48.2倍。在肝癌H22动物模型中,DOX和DOX-DCA NPs的肿瘤治疗效果相当;而在黑色素瘤B16F10动物模型中,DOX-DCA NPs的抗肿瘤效果比游离药物DOX略差,但剂量提高至15 mg/kg后,其治疗效果和安全性均好于DOX。最大耐受剂量实验(maximum tolerated dosage,MTD)实验进一步表明DOX-DCA NPs可显著降低DOX所致的心脏和肝脏毒性,体内安全性好。DOX-DCA NPs的MTD为75mg DOX equiv./kg,是游离药物DOX(5 mg/kg)的15倍。同时游离药物DOX 10mg/kg和DOX 15mg/kg给药组均出现明显的心脏损伤和肝脏损伤。且DOX 15mg/kg给药组小鼠血浆中血生化参数LDH、ALT和AST水平发生显著性变化,而DOX-DCA NPs给药组均无明显改变。一系列Pt(IV)-ADD药物-药物偶联体均可在水中自组装形成纳米粒。引入磷脂DSPE-PEG后,形成Pt(IV)-ADD@DSPE-PEG NPs,其稳定性大大提高。各纳米粒的粒径在60-140 nm之间,PDI值较小,电镜下呈现均一、分散的球形。随着碳链长度的增加,纳米粒的粒径逐渐增大。Pt(IV)-ADD前药在上述纳米粒中的包封率(78.8%-92.6%)和载药量(84.0%-86.0%)均高于目前绝大多数纳米药物。六种纳米粒的稳定性有所差异,其中C_2-Pt-ADD@DSPE-PEG NPs、C_8-Pt-ADD@DSPE-PEG NPs、C_(12)-Pt-ADD@DSPE-PEG NPs和Pt-2ADD@DSPE-PEG NPs的稳定性较好,在PBS中可稳定存在270 d;而C_4-Pt-ADD@DSPE-PEG NPs和C_6-Pt-ADD@DSPE-PEG NPs的稳定性时长仅分别为48 h和24 h。自组装纳米系统是一个动态的过程,C_4-Pt-ADD@DSPE-PEG NPs和C_6-Pt-ADD@DSPE-PEG NPs会发生结构的二次自组装,进而产生形态的改变,分别倾向形成纤维和层状这两种热力学更稳定的结构。为了验证上述纳米粒的抗肿瘤效果,在体外细胞杀伤实验中,我们分别运用了以下三种细胞系:顺铂耐药细胞(三阴性乳腺癌MDA-MB-231)和敏感细胞(肝癌HepG2、非小细胞肺癌A549)。各游离药物或其自组装纳米粒的杀伤效果强弱大体如下:C_4-Pt-ADDC_6-Pt-ADDC_2-Pt-ADDC_8-Pt-ADDC_(12)-Pt-ADDPt-2ADD。C_4-Pt-ADD和C_6-Pt-ADD的杀伤能力较好,可能与其结构可发生二次重排有关。在敏感和耐药细胞中,自组装药物均展示出显著增强的抗肿瘤效果,其中在耐药细胞中,其杀伤指数最高可增强266.4倍,可以大幅减轻顺铂的耐药问题。体内耐药肿瘤抑制实验表明C_2-Pt-ADD@DSPE-PEG NPs可几乎完全抑制肿瘤的生长,并有效减轻顺铂引起的体重下降问题,具有很好的体内安全性。综上所述,本课题成功构建了两种基于药物-药物偶联体的自组装纳米药物递送系统,成功的克服了DOX的副作用和顺铂在治疗过程中的耐药问题和不良反应,两种纳米体系制备简单、载药量高,有效降低了载体的使用量,可克服传统纳米粒中载体的复杂性和多样性所带来的问题,为纳米粒的大规模生产和临床转化提供新思路。
【学位单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R943
【部分图文】：

示意图,纳米药物,自组装,载体

华中科技大学博士学位论文的纳米药物，自组装纳米药物的组成明确，可以降低载体的使用量和多样性，降低纳米体系的复杂性，减少载体所带来的一系列问题。⑤通常自组装纳米药物的制备方法为纳米沉降法，属于自下而上的制备方式，操作简单，为纳米药物的大规模生产提供了极大的可能性[11, 13-15]。综上，利用上述自组装纳米药物可大大降低载体的使用量和种类，提高药物的包封率和载药量，减少药物浪费，避免制备中引入大量载体而引起的生产成本增加、代谢、排泄和免疫原性等安全隐忧，降低纳米体系的复杂性和不稳定性，推动纳米药物的大规模生产。

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安全性研究Doxorubicin,DOX）是一种广谱抗肿瘤药物，临床上常用于，卡波西肉瘤，淋巴瘤和急性淋巴细胞性白血病等多种疾方式主要为直接插入DNA双链中或抑制DNA拓扑异构酶录和生物大分子的合成。此外，DOX还可以生成超氧自由和功能。然而，DOX的临床应用极大地受到了其急性和慢脏毒性、骨髓抑制、肝毒性、脑毒性、呕吐、恶心和静脉硬产生副作用的具体机制目前尚不清楚，但多数学者认ygen species, ROS）的生成和氧化应激系统的激活在其毒用[1, 4]。

路线图,路线

华中科技大学博士学位论文1H), 2.14 (m, 2H), 2.93 (m, 2H), 3.4 (s, 1H), 3.97 (s, 3H), 4.2 (q, 1H), 4.58 (s, 2H),4.87 (s, 1H), 4.92 (m, 1H), 5.05 (d, 1H), 5.25 (d, 1H), 5.45 (s, 1H), 6.50 (s, 1H), 7.63(m, 1H), 7.88 (m, 2H), 8.34 (d, 1H), 13.25 (s, 1H), 14.02 (s, 1H). ESI-MS (negativemode) C29H29Cl2NO12: [M-H]-, cald, (m/z) 652.1; found, 652.3. Purity (HPLC): 98.5%.

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