人死亡受体5抗体融合蛋白对肝炎治疗作用及机制的研究

发布时间：2020-09-29 06:29

　　中国是世界第一肝炎大国,且乙肝病毒感染引起的肝衰竭是我国最常见的肝脏疾病死亡原因。在西方国家,过量服用对乙酰氨基酚(Acetaminophen,APAP)是导致急性肝衰竭的最主要原因。目前临床上对肝炎,尤其是肝衰竭仍缺乏有效的治疗药物,因此开展高效低毒的肝炎/肝衰竭治疗新药的研发具有重要的实用价值和社会意义。鉴于细胞死亡在几乎所有类型的肝脏疾病中具有决定性作用,目前靶向凋亡和坏死性凋亡成为治疗肝病的研究方向之一。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis inducing ligand,TRAIL)是人体内最重要的诱导细胞凋亡的分子之一,在多种肝炎发生发展过程中发挥重要作用。死亡受体5(Death receptor 5,DR5)是亲和力最高的TRAIL受体,天然状态下可以可溶性DR5(Soluble DR5,即sDR5)存在。sDR5能结合TRAIL,但不能传导信号,从而阻断TRAIL介导的细胞凋亡。本研究通过制备重组人sDR5和免疫球蛋白Fc片段(sDR5-Fc)融合蛋白,并对其在小鼠、大鼠和食蟹猴体内的药理、安全性、药代动力学、疗效和机制进行了研究。主要研究内容包括以下4个方面:(1)sDR5-Fc蛋白的制备和特性研究。通过基因工程技术,融合DR5细胞外结构域和人IgG1 Fc片段基因,转染CHO-K1细胞,筛选获得稳定高表达sDR5-Fc的细胞株。通过大规模细胞培养和蛋白纯化,获得药用级的sDR5-Fc蛋白,纯度超过99%,亲和力达E-10 M,能特异性结合TRAIL,有效阻断TRAIL诱导的细胞凋亡。(2)sDR5-Fc在刀豆蛋白A(Concanavalin A,Con A)诱导肝炎模型中的药效学研究。sDR5-Fc能有效治疗Con A诱导的小鼠肝炎/肝衰竭。在机制上,sDR5-Fc在体内可以抑制肝细胞死亡,减轻炎症反应。在体外,sDR5-Fc可以抑制Con A或抗CD3抗体激活的脾细胞产生炎性细胞因子,通过下调NF-κB的活化。与这些结果一致的是,TRAIL~( / )小鼠注射Con A后,或其脾细胞在Con A或抗CD3抗体激活后,产生的炎性细胞因子水平均比TRAIL~(+/+)小鼠显著性低。(3)sDR5-Fc在APAP诱导肝炎模型中的药效学研究。sDR5-Fc能有效治疗APAP诱导的小鼠肝炎/肝衰竭。机制上,APAP诱导小鼠的肝损伤严重程度和死亡率与血清sTRAIL水平相关。APAP诱导大量CD11b~+Gr1~+中性粒细胞浸润肝脏,这些细胞的膜表面表达TRAIL,可以分泌sTRAIL,杀伤表达DR5的肝细胞。另外,这些细胞表达CD80、CD86和MHCⅡ分子,可以促进T细胞增殖。APAP通过上调DR5的表达,使肝细胞对TRAIL诱导的细胞死亡更敏感。因此,TRAIL-DR5信号通路在APAP诱导的肝炎/肝衰竭中起关键的作用。sDR5-Fc能减少肝脏细胞的凋亡,减轻肝脏炎症,恢复肝脏功能。sDR5-Fc能与N乙酰半胱氨酸协同治疗APAP诱导的肝炎/肝衰竭。(4)sDR5-Fc的安全性研究。单次静脉输注sDR5-Fc的最大耐受剂量在小鼠、大鼠和食蟹猴中分别超过2198、1500和1200 mg/kg。重复静脉输注13周sDR5-Fc的未观察到不良反应剂量在大鼠和食蟹猴中分别为200和100 mg/kg。sDR5-Fc药物呈线性动力学特征,在食蟹猴中平均半衰期1.9天。sDR5-Fc重复静脉输注给予食蟹猴12周后,sDR5-Fc暴露量以近似剂量比例增加,平均蓄积因子为1.82~2.11倍。sDR5-Fc静脉注射给予大鼠后,主要分布在血浆,通过尿液排出。综上所述,sDR5-Fc,作为第一个药用TRAIL阻断剂,在治疗TRAIL驱动的肝炎、肝衰竭疾病中安全有效,有望发展成为新的肝炎、肝衰竭治疗药物。
【学位单位】：中国科学院大学(中国科学院深圳先进技术研究院)
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R96
【文章目录】：
摘要
abstract
缩略词说明
第1章引言
    1.1 TRAIL分子及其受体简介
    1.2 TRAIL信号通路
        1.2.1 TRAIL促凋亡信号通路
        1.2.2 TRAIL促坏死性凋亡信号通路
        1.2.3 TRAIL诱导的非细胞死亡信号通路
    1.3 肝炎/肝衰竭简介
    1.4 TRAIL在肝炎/肝衰竭中的作用
    1.5 肝炎/肝衰竭的治疗现状
    1.6 sDR5阻断TRAIL治疗细胞死亡
第2章 sDR5-Fc新药的制备和特性研究
    2.1 研究背景
        2.1.1 Fc融合蛋白研究现状
        2.1.2 sDR5-Fc蛋白研究现状
    2.2 材料与方法
        2.2.1 实验试剂
        2.2.2 实验仪器
        2.2.3 实验耗材
        2.2.4 建立稳定表达sDR5-Fc蛋白的细胞库
        2.2.5 sDR5-Fc蛋白的生产
        2.2.6 TRAIL杀伤活性检测
        2.2.7 sDR5-Fc生物活性检测
        2.2.8 sDR5-Fc与配体结合特异性检测
        2.2.9 sDR5-Fc亲和力检测
        2.2.10 sDR5-Fc与Fc受体结合能力检测
    2.3 实验结果
        2.3.1 sDR5-Fc蛋白分子量与纯度
        2.3.2 sDR5-Fc与不同物种来源TRAIL结合亲和力
        2.3.3 sDR5-Fc体外生物活性
        2.3.4 sDR5-Fc结合配体特异性
        2.3.5 sDR5-Fc与多种Fc受体的结合活性
        2.3.6 sDR5-Fc与细胞膜表面DR5的结合活性
    2.4 讨论
第3章 sDR5-Fc新药的药效学研究
    3.1 研究背景
        3.1.1 Con A诱导的肝炎
        3.1.2 APAP诱导的肝炎
    3.2 材料与方法
        3.2.1 建立Con A诱导的肝炎或肝衰竭模型
        3.2.2 建立APAP诱导的肝炎或肝衰竭模型
        3.2.3 小鼠外周血单个核细胞的分离
        3.2.4 小鼠脾脏细胞的分离
        3.2.5 小鼠肝脏免疫细胞的分离
        3.2.6 小鼠血清检测
        3.2.7 吲哚菁绿清除法测肝脏功能
        3.2.8 流式细胞分析
        3.2.9 小鼠肝脏mRNA水平检测
        3.2.10 组织病理检测
        3.2.11 石蜡切片免疫组织化学染色
        3.2.12 冰冻切片免疫荧光染色
        3.2.13 蛋白质免疫印迹检测
        3.2.14 脾细胞体外刺激培养
        3.2.15 肝细胞DR5 敲低
        3.2.16 CD11b~+Gr1~+细胞功能实验
        3.2.17 细胞涂片免疫荧光染色和Giemsa染色
        3.2.18 统计分析方法
    3.3 实验结果
        3.3.1 sDR5-Fc治疗Con A诱导的急性肝炎/肝衰竭的药效研究
        3.3.2 sDR5-Fc治疗APAP诱导的急性肝炎/肝衰竭的药效研究
    3.4 讨论
        3.4.1 Con A与APAP诱导肝炎/肝衰竭模型的比较
        3.4.2 sDR5-Fc在Con A模型中的药效讨论
        3.4.3 sDR5-Fc在APAP模型中的药效讨论
第4章 sDR5-Fc新药非临床安全性研究
    4.1 研究背景
        4.1.1 免疫原性评价
        4.1.2 非临床安全性评价
    4.2 材料与方法
        4.2.1 检测血清中抗sDR5-Fc抗体含量的ELISA方法
        4.2.2 检测血清中抗sDR5或抗Fc抗体含量的ELISA方法
        4.2.3 检测猴血清中sDR5-Fc浓度的ELISA方法
        4.2.4 生产人Fc和sDR5蛋白
        4.2.5 安全性评价动物实验
    4.3 实验结果
        4.3.1 sDR5和Fc蛋白生产
        4.3.2 检测血清中抗sDR5或抗Fc抗体含量
        4.3.3 检测血清中抗sDR5-Fc抗体含量
        4.3.4 检测猴血清中sDR5-Fc浓度
        4.3.5 sDR5-Fc单次静脉输注毒性研究
        4.3.6 sDR5-Fc重复静脉输注毒性研究
        4.3.7 sDR5-Fc的药代动力学研究
        4.3.8 sDR5-Fc的分布及排泄研究
    4.4 讨论
第5章结论与展望
参考文献
附录
致谢
作者简历
博士期间发表的学术论文
博士期间发表的专利
博士期间参加的主要研究项目
博士期间所获得的奖励

【参考文献】