肿瘤微环境响应的多烯紫杉醇前药治疗肺癌骨转移的靶向递送系统的构建及评价

发布时间：2020-09-29 10:51

　　 多烯紫杉醇(DTX)是第二代紫杉烷类抗肿瘤药,其作为原发肺癌治疗的一线或二线临床用药,具有确切的疗效,但对于临床上高发的肺癌骨转移疗效差且毒副作用大,主要原因是多烯紫杉醇对骨上转移的肺癌肿瘤细胞的靶向性差,达不到足够的治疗剂量。为了解决这个瓶颈问题,本研究首先采用了肿瘤血管靶向的二十二碳六烯酸(DHA)偶联的牛血清白蛋白(BSA)作为载体(DHA-BSA)包载药物来增强药物的肿瘤靶向性。其次考虑到DHA-BSA包载的多烯紫杉醇缓释造成的毒性不可耐受,利用氧化还原双敏感的单硫醚键作为化学连接臂设计了多烯紫杉醇前药(DTX-S-DTX),基于肿瘤组织内存在高氧化还原微环境,实现多烯紫杉醇的肿瘤组织的控释给药。最后采用乳化法将前药与载体制备成纳米粒(DTX-S-DTX-DHA-BSA-NPs)。本研究构建了肿瘤微环境响应的多烯紫杉醇前药治疗肺癌骨转移的肿瘤靶向递送系统,并对该体系进行评价,所得研究结果如下:1.DTX-S-DTX前药的合成:以单硫醚键作为氧化还原敏感的化学连接臂设计了DTX-S-DTX前药,再利用质谱及核磁共振氢谱等手段,确定了 DTX-S-DTX合成成功。2.DTX-S-DTX-DHA-BSA-NPs的制备及优化:首先选择DHA上的羧基和牛血白蛋白的氨基通过混合酸酐法进行酰胺化反应,得到DHA偶联的牛血白蛋白作为肿瘤血管靶向的载体。制备DTX-S-DTX-DHA-BSA-NPs采用单因素实验优化其制备条件,优化结果为偶联蛋白(DHA-BSA)浓度5 mg/mL、有机相与水相的体积比1:16、匀浆转速6000 rpm、匀浆时间6 min、均质压力800 bar、均质次数7次。在此优化条件下,制备的 DTX-S-DTX-DHA-BSA-NPs 的粒径 98.8±11.7 nm,电位-20.901±1.24 mV,载药量7.86%±1.4%,包封率 84.6%±4.3%,DTX-S-DTX-DHA-BSA-NPs 中 DHA 含量为4.04%土1.2%,n=3。3.DTX-S-DTX-DHA-BSA-NPs 的表征:①扫描电子显微镜形态学观察:DTX-S-DTX呈现不均匀长片状,并且粒径大小为微米级;DTX-S-DTX-DHA-BSA-NPs呈现近似球形,粒径大小在100 nm左右。②X 射线衍射检测:DTX-S-DTX 在 10.71°、12.15°、13.57°、17.14°和 19.29°等处出现了大量衍射峰,且峰强度大;DTX-S-DTX与DHA-BSA的物理混合物在19.27°和31.66°处出现两个衍射峰,且峰强度明显变小;DTX-S-DTX-DHA-BSA-NPs在19.28。处出现一个衍射峰,且峰强度明显变小。表明DTX-S-DTX-DHA-BSA-NPs结晶度减小,DTX-S-DTX以无定型形态存在于纳米粒中,所以DTX-S-DTX-DHA-BSA-NPs表现出较好的水溶性。③热差分析检测:DTX-S-DTX原药在216.07℃时出现一个较强的热吸收峰,表明其是晶体状态,而DTX-S-DTX与DHA-BSA的物理混合物在216.07℃时热吸收峰十分微弱,表明有少量DTX-S-DTX晶体被DHA-BSA的表面吸附,DTX-S-DTX-DHA-BSA-NPs 在 216.07°C热吸收峰消失,表明在 DTX-S-DTX-DHA-BSA-NPs 中的 DTX-S-DTX以无定形态存在。4.DTX-S-DTX-DHA-BSA-NPs 的复溶稳定性实验:冻干的 DTX-S-DTX-DHA-BSA-NPs复溶于去离子水后在0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h时间点分别测定其粒径和电位,结果分别为 97.4±15.3 nm和-20.90±1.63 mV、101.0±14.8 nm 和-21.37 土1.83 mV、104.2±15.9 nm 和-21.56±1.36 mV、110.3±15.9 nm 和-20.76±0.92 mV、122.0±17.1 nm 和-19.33±1.88 mV、129.1±16.6 nm 和-19.92±1.43 mV、146.0±18.1 nm和-19.86±1.47 mV,其粒径和电位值在8 h内未出现较大变化且均在220 nm以下,表明其稳定性较好。5.DTX-S-DTX-DHA-BSA-NPs的体外释放实验:将含30%乙醇的PBS缓冲液(pH=7.4)作为释放介质,考察了 DTX-S-DTX-DHA-BSA-NPs在添加过氧化氢(H2O2)或二硫苏糖醇(DTT)条件下释放DTX的释放情况。结果表明,在不添加过氧化氢(H2O2)或二硫苏糖醇(DTT)的释放介质中,12 h内有10.4%±2.4%DTX从纳米粒中释放出来。而添加5 mM H2O2、10 mM H2O2、5 mM DTT、10 mM DTT的4种释放介质中,12 h 内分别有 88.1%±8.7%、91.3%±8.1%、34.7%±5.2%、41.6%±3.8%的DTX从DTX-S-DTX-DHA-BSA-NPs中释放出来,这说明设计的DTX-S-DTX前药能在氧化还原环境中快速释放DTX。6.DTX-S-DTX和DTX-S-DTX-DHA-BSA-NPs的急毒性实验:采用昆明小鼠建立模型,分别以 5 μmoL/kg、10 μmoL/kg、15 μmoL/kg、20 moL/kg 和 25μmoL/kg 剂量的DTX-S-DTX和DTX-S-DTX-DHA-BSA-NPs给药,并观察小鼠的生存状态、记录小鼠体重。实验结果表明,DTX-S-DTX的最大耐药剂量为5 μmoL/kg,DTX-S-DTX-DHA-BSA-NPs的最大耐药剂量为10μmoL/kg。7.DTX-S-DTX-DHA-BSA-NPs体内抗肿瘤活性研究:采用C57BL/6小鼠建立肺癌骨转移模型,研究DTX-S-DTX-DHA-BSA-NPs的抑制肺癌骨转移活性,空白对照组的平均生存期为19.86±2.96 d,5 μmoL/kg DTX组的平均生存期为25.43±1.38 d,2.5μmoL/kg DTX-S-DTX 组的平均生存期为 26.71±1.34 d(P0.05),2.5 μmoL/kg DTX-S-DTX-DHA-BSA-NPs 组的平均生存期为 29.29±2.37 d(P0.01),5 μmoL/kg DTX-S-DTX-DHA-BSA-NPs组的平均生存期为33.00±2.55 d(P0.01)。抗肺癌骨转移活性研究中,空白对照组的平均体重为26.08±1.67 g,5 μmoL/kg DTX组的平均体重为24.45±1.89 g,2.5 μmoL/kg DTX-S-DTX 组的平均体重为 24.30 土 1.88 g,2.5 μmoL/kg DTX-S-DTX-DHA-BSA-NPs 组的平均体重为 26.39±2.30 g,5μmoL/kg DTX-S-DTX-DHA-BSA-NPs组的平均体重为26.98±2.43 g。以上数据表明DTX-S-DTX-DHA-BSA-NPs比DTX或DTX-S-DTX对肺癌骨转移具有更强的抑制作用,提高了小鼠的平均生存时间,同时降低了药物的非肿瘤组织毒性。本文制备的DTX-S-DTX-DHA-BSA-NPs具有较好的的水溶性、复溶稳定性、肿瘤靶向性、肿瘤组织释药可控性和较低的毒副作用,从而也具有了较强的抗肺癌骨转移作用,具有了进一步开发为抗肺癌骨转移药物的潜在价值。本研究将为肺癌骨转移肿瘤靶向输送系统设计提供新思路,为临床上突破肺癌骨转移治疗瓶颈打下坚实理论与实践基础。
【学位单位】：东北林业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R943;R96
【部分图文】：

脂肪酸对于肿瘤细胞也就形成了邋“营养靶向”的作用［１（）３］。正因如此有人设计了紫杉醇－不逡逑饱和脂肪酸前药来解决因大量使用辅料带来的不良反应以及增加药物的靶向性［１（）４１。比逡逑如紫杉醇－二十二碳六烯酸前药（ＰＴＸ－ＤＨＡ．化学结构见图１－３）已经进入临床试验ＩＩＩ期逡逑［１Ｑ５，＿。此外，还有反油酸－阿糖胞苷前药ｌｌＧ３１邋（ＣＰ－４０５５），己经进入临床ＩＩＩ期、反油酸－逡逑吉西他滨前药（ＣＰ－４１２６），能够进入临床ＩＩ期。总而言之，不饱和脂肪酸－抗肿瘤药逡逑物前药的优点在于ｌｌＣ）３］：邋（１）将两者相连有利于增强抗肿瘤药物的稳定性，防止药物被逡逑清除（２）增强了极性药物的脂溶性，有助于其跨膜运输（３）由于快速生长的肿瘤细胞逡逑对营养物质需求更大，借此可以实现不饱和脂肪酸的肿瘤＂营养靶向”药物传递；（４）逡逑增强部分抗肿瘤药物的化疗敏感性（５）利用前药原理，降低抗肿瘤药物的毒副作用。逡逑ＡｃＣ＼邋Ｐ邋ＯＨ逡逑Ｉ邋ｘＭＡ逡逑Ｐｈ＾＾ＮＨ邋0邋／逡逑

逦东北林业大学硕士学位论文逦逡逑子结构均易发生裂解，形成一些质谱碎片峰［１１９］。由于ＤＴＸ－Ｓ－ＤＴＸ邋（Ｍ）中Ｃ－Ｓ键极易逡逑断裂形成Ｍｉ：邋ｍ／ｚ邋８４８．３５３４和Ｍ２：邋ｍ／ｚ邋８８１．５４４５，通过对图２－３中碎片峰的解析，符合目逡逑标产物ＤＴＸ－Ｓ－ＤＴＸ的裂解特点。解析结果见表２－３。逡逑

３．７结果与讨论逡逑３Ｊ．１红外光谱测定结果逡逑ＢＳＡ、ＤＨＡ和ＤＨＡ－ＢＳＡ三者的红外光谱图的对比结果如图３－１所示：ＢＳＡ的红逡逑外光谱图中，在３５００？３１００邋ｃｎｆ１处有吸收峰，即５号峰，是Ｎ－Ｈ伸缩振动峰；在１６５３．５逡逑ｃｍ＇１和１５３１邋ｃｎＴ１处有两个明显的吸收峰，如图２、３号峰所示。ＤＨＡ的红外光谱图逡逑中，在３００８邋ｃｍ＿１为不饱和＝Ｃ－Ｈ伸展运动的吸收，如４号峰所示；１０００？１５００ｃｍ＿１处有－逡逑ＣＨ２－、－ＣＨ３－弯曲振动和Ｃ＝０伸展振动，是结构中有酯的特征吸收，如图中１处峰。逡逑ＤＨＡ－ＢＳＡ中出现酰胺键的强特征吸收峰增强如图中６号峰所示

【参考文献】

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本文编号：2829624