功能化纳米药物载体的制备及应用

发布时间：2020-09-29 13:50

　　内源性一氧化氮(NO)是生物体内重要的生物信使分子之一，具有“明星分子”之称。其对体内炎症的形成与发展，血小板、白细胞的聚集及血管舒张；血栓形成，血液循环，细胞凋亡等多个系统的正常生理功能起重要作用。但是各项生理功能对一氧化氮的需求量不同，一氧化氮过高或过低都会严重威胁人类健康。所以发展一种可控释放内源性一氧化氮载体药物是非常有必要地。癌症是由于细胞过度繁殖而引起的恶性肿瘤进而损害人类的健康的一种疾病。随着社会的不断进步，环境也遭受着严重破坏，从而使得人类癌症的发病率日渐增长。近年来，虽然医学研究领域研发发展了多种药物来治疗癌症，但对多数癌症的治疗效果仍难以令人满意。目前治疗癌症的方法有临床手术，放射性治疗和药物化疗。目前药物化疗治愈癌症是走在医学前端。但是传统药物化疗对人体伤害极大，轻微的症状是掉头发，严重的话可能致死。而纳米材料的兴起为抗癌药物的发展带来了新的契机。因此，开发安全、稳定，具有多功能的药物载体和可控的药物释放载体药物对人类不管是生理功能疾病或是癌症的治疗都具有重要意义。纳米材料具有比表面积大，易修饰等优良性能，可实现抗癌药物高效、靶向的输运，因此发展以纳米材料为基质的靶向的，结合化疗与热疗为一体的多功能抗癌药物是癌症药物发展的热点与趋势，对癌症的治疗都具有举足轻重的意义。本论文基于生物相容性好的壳聚糖修饰金纳米粒子发展了一种可用来诱导内源性NO供体可控释放一氧化氮的药物，从而为NO药物的发展提供了一种新思路。聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)纳米载体由于其生物相容性好，易于进入细胞且可实现药物在体内缓释等优点而引起人们的广泛关注。鉴于此，本论文发展了一种。PLGA包裹甲氨蝶呤和金纳米棒共价连接带有荧光的可特定靶向肿瘤细胞AS1411适配体多功能纳米药物，该药物实现了靶向性的化疗(甲氨蝶呤)-热疗(金纳米棒)联合疗法，为新型抗癌药物的发展提供了新思路。具体研究内容如下： 1、基于内源性一氧化氮是生物体内重要的调控分子之一，NO过高或过低都会严重威胁人类健康。纳米金可以催化内源性NO供体亚硝基硫醇(RSNO)释放NO从而制备了生物相容性好的壳聚糖(CS)功能化金纳米粒子催化亚硝基化的谷胱甘肽(GSNO)用于可控释放NO。在本实验中，我们合成制备了一种用壳聚糖表面修饰金纳米粒子(AuNPs@CS)的功能化材料用来控制体内内源性供体亚硝基硫醇一氧化氮的释放。这个实验的设计是用金纳米粒子(AuNPs)作为催化一氧化氮的活性元素，而壳聚糖是用来提供控制释放的开关。在本实验中通过电化学和电子自旋共振仪(ESR)可以检测到一氧化氮的释放信号。实验结果证明：一氧化氮的释放量与金纳米粒子表面修饰的壳聚糖的量成反比，壳聚糖越多，一氧化氮释放量越少。这个实验的机理是：AuNPs@CS纳米粒子中的金纳米颗粒与RSNO相互作用时，由于Au-SR键的作用力大于RS-NO键作用力从而使RS-NO键断裂释放一氧化氮同时在金表面生成Au-SR。随着壳聚糖的增多，金纳米粒子表面有效作用位点减少，被用来催化RSNO释放一氧化氮的表面越少，NO的释放量就减少因而可通过调节金纳米表面壳聚糖的量实现一氧化氮的控制释放。由于AuNPs@CS是一种生物相容性好的材料，所以这是一种具有应用前景的治疗手段。 2、基于大部分的抗癌药物均为疏水性化合物这类化合物在临床应用方面因存在着水溶性差、毒副作用大等缺点而限制了其应用。如何解决上述问题，对于抗癌药物的临床应用具有重要的意义。而PLGA作为药物载体能增加治疗的有效性，减少毒性和可生物降解的性质。本论文设计思路如下：通过溶剂挥发乳化法制备了由PLGA包裹甲氨蝶呤(MTX)抗癌药物。并且使用动态光散射(DLS)、扫描电镜(SEM)、透射电镜(TEM)和紫外可见光谱(UV-vis)等手段进行表征。通过对超声功率影响PLGA纳米粒粒径因素的研究，确定了以800W功率下制备的PLGA粒径较小的最佳条件:dPLGA=82.3±4.2nm。该载药率和体外药物释放研究用紫外光谱法在不同pH值下的PBS溶液进行。并且对肺癌细胞(A549)进行毒性研究。综上所述：我们合成了纳米载体PLGA，以疏水性的抗癌药物甲氨蝶呤(MTX)为代表药，通过疏水作用将MTX负载到PLGA中，制备了PLGA负载的MTX纳米颗粒(PLGA@MTX)。经过体外释放实验发现，PLGA@MTX在酸性下可快速释放，中性缓慢释放，有效地提高了药物的利用度。通过细胞毒性实验，发现PLGA具有较高的生物安全性，负载MTX后，提高了药效。这说明，PLGA可以用于疏水药物的载体。 3、基于金纳米棒在近红外区域有很强的吸收峰。当用近红外光照射金纳米棒时，金纳米棒能吸收的光能转化为热能释从而杀死癌细胞。本论文设计思路通过溶剂挥发乳化法制备了由PLGA包裹的金纳米棒(AuNRs)、甲氨蝶呤(MTX)多功能纳米药物，并用荧光修饰的AS1411适配体对其表面进行修饰达到靶向导入与荧光成像的多功能的纳米药物载体AS1411-PLGA@MTX-AuNRs，该多功能纳米药物可靶向到癌细胞，并对癌细胞进行荧光成像，然后在近红外光的照射下，金纳米棒的光热效应和甲氨蝶呤化疗效应联合治疗杀死细胞，避免了单一疗法的局限性。在论文中用动态光散射(DLS)、透射电镜(TEM)和紫外可见光谱(UV-vis)对所制备的多功能纳米药物载体进行了表征。用紫外光谱法对其载药率和体外药物释放进行了研究。同时对肝癌细胞HEPG-2和正常肝细胞LO-2进行了毒性研究，共聚焦显微镜证实了粒子的细胞摄取和靶向给药。光治疗实验证明了化疗加热疗联合疗法比单纯的就是用药治疗癌症效率高，它能避免单一疗法的局限性。该纳米粒子的形态分析证明了颗粒的形状和大小为107.2±1.8nm，由细胞实验证实了在相同的载药量下，与没有接靶向分子的纳米粒子相比，AS1411适配体功能化的纳米粒子显著增强了肿瘤的杀伤作用。此外，该PLGA@MTX-AuNRs纳米粒子具有较高的包封率和优越的药物缓释。综上所述, AS1411-PLGA@MTX-AuNRs纳米粒子是一种靶向性药物输送并将光疗-化疗相结合的一种高效的多功能抗癌药物在靶向药物输送载体和光照-化疗联合疗法可以有效地诱导细胞凋亡,避免单一疗法的局限性并且不伤害正常细胞。
【学位单位】：南昌航空大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2014
【中图分类】：R943
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章前言
    1.1 纳米药物载体的研究
        1.1.1 纳米药物载体概述
        1.1.2 纳米药物载体优势
        1.1.3 纳米药物载体的应用
    1.2 纳米药物载体的常用材料
        1.2.1 壳聚糖(CS)
        1.2.2 聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)
        1.2.3 复合纳米药物载体
    1.3 纳米金的应用
        1.3.1 不同大小与不同形状的纳米金的制备
        1.3.2 金纳米粒子作为载药的研究
        1.3.3 金纳米粒子传送双原子分子
        1.3.4 纳米金的光热治疗
    1.4 常用载体药物
        1.4.1 喜树碱
        1.4.2 紫杉醇
        1.4.3 甲氨蝶呤
    1.5 选题背景和研究意义
    参考文献
第二章壳聚糖表面修饰金纳米粒子用于催化内源性一氧化氮的释放
    2.1 前言
    2.2 实验部分
        2.2.1 化学试剂与仪器
        2.2.2 金纳米粒的制备
        2.2.3 合成水溶性壳聚糖
        2.2.4 制备壳聚糖修饰金纳米粒子（CS@AuNPs）
        2.2.5 制备亚硝基硫醇（GSNO)的水溶液
        2.2.6 电化学检测一氧化氮
        2.2.7 ESR 检测一氧化氮
    2.3 结果与讨论
        2.3.1 合成与表征
        2.3.2 电化学检测 CS@AuNPs 诱导一氧化氮的释放
        2.3.3 电子自旋共振仪（ESR）检测一氧化氮
    2.4 结论
    参考文献
第三章 PLGA 纳米载体的制备与应用
    3.1 前言
    3.2 实验部分
        3.2.1 试剂与仪器
        3.2.2 PLGA 纳米粒子的制备
        3.2.3 MTX@PLGA 纳米粒子的制备
    3.3 所制得的纳米粒表征
        3.3.1 动态光散射(DLS)
        3.3.2 扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscopy, SEM）
        3.3.3 透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy, TEM）
        3.3.4 PLGA@MTX 紫外可见光谱(UV-vis)
    3.4 MTX 标准曲线的建立
    3.5 包载率和释放的研究
    3.6 细胞实验步骤
        3.6.1 细胞的复苏
        3.6.2 细胞的传代
        3.6.3 细胞的铺板
    3.7 MTT 实验
        3.7.1 MTT 法的原理
        3.7.2 MTT 溶液的配制方法
        3.7.3 PBS 溶液的配制
    3.8 PLGA 生物安全性和 PLG@MTX 的细胞毒性
    3.9 结论
    参考文献
第四章具有荧光靶向性的纳米载体药物的制备及应用
    4.1 前言
    4.2 实验部分
        4.2.1 试剂与仪器
        4.2.2 金纳米棒的制备
        4.2.3 PLGA 纳米粒子的制备
        4.2.4 MTX@PLGA 纳米粒子的制备
        4.2.5 AuNRs-MTX@PLGA 纳米粒子的制备
        4.2.6 AS1411Aptamer 共聚 AuNRs-MTX@PLGA
    4.3 所有制得的纳米粒表征
        4.3.1 动态光散射(DLS)
        4.3.2 扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscopy, SEM）
        4.3.3 透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy, TEM）
        4.3.4 紫外可见光谱(UV-vis)
    4.4 释放研究
        4.4.1 包载率研究
        4.4.2 体外释放研究
    4.5 细胞实验步骤
        4.5.1 细胞的复苏
        4.5.2 细胞的传代
        4.5.3 细胞的铺板
    4.6 MTT 实验
        4.6.1 MTT 法的原理
        4.6.2 MTT 溶液的配制方法
        4.6.3 PBS 溶液的配制
    4.7 PLGA 生物安全性评价
    4.8 PLGA@MTX-AuNRs 的细胞毒性测试
    4.9 Apt-PLGA@MTX-AuNRs 毒性实验研究
    4.10 AuNRs-MTX@PLGA 的光治疗实验
    4.11 激光共聚焦显微镜
    4.12 结论
    参考文献
第五章结论与展望
    5.1 结论
    5.2 展望
致谢
发表文章与申请专利情况说明

【共引文献】