内质网蛋白AGR2介导肿瘤化疗药物与靶向药物耐受的分子机制及应对策略研究

发布时间：2020-09-29 18:49

　　 恶性肿瘤是严重威胁人类健康的重大疾病,其治疗以手术治疗,放射治疗、化学疗法以及近年来的免疫治疗为主。无论是放疗、化疗还是免疫治疗,耐药和精准用药的选择性不高是制约其治疗的难题。虽然免疫治疗的优势显著,但患者的应答率不高,因此化疗虽有诸多不尽人意,但依然侵袭转移性肿瘤的治疗方案。近年来靶向药物的出现,为肿瘤患者带来新的希望。靶向药物靶点明确,但是耐药迅速,并且只有少数靶向药物有耐药标志物。目前临床上缺乏精准有效的指示标志物来预测化疗与靶向治疗效果,因此临床上亟待发现新的指示标志物,用以精准用药,提高患者生存率及生存治疗。AGR2是二硫键异构酶家族成员,虽然是内质网定位蛋白,但AGR2仍可定位于细胞胞质和分泌至细胞外,具有分泌特性。AGR2作为癌基因,在多种肿瘤中高表达:1)可显著促进肿瘤的增殖与侵袭转移;2)其分泌特性,提示可作为肿瘤的诊断标志物;3)可作为药物靶点,已有AGR2抗体药物的研究报道。作为药物靶点,已有研究发现AGR2与耐药有关,对乳腺癌内分泌治疗耐受。目前AGR2与肿瘤耐药的研究较少。因此本论文首先通过药物筛选,确定AGR2表达与肿瘤治疗化疗药物和靶向药物的关联,发现其表达显著影响药物的药效。随后对其耐药机制进行研究,发现细胞内和分泌的AGR2均通过不同的机制参与耐药,最后通过AGR2介导的耐药机制探讨其应对方案,并确定分泌的AGR2可作为化疗以及血管靶向药物的用药指示标志物,并根据AGR2的表达提出序贯用药的策略。第一部分AGR2表达对肿瘤化疗药物和靶向药物敏感性的影响AGR2被认为是一种癌基因,能够显著促进癌细胞增殖与侵袭转移,并且多个报道显示AGR2能够促进癌细胞抵抗细胞死亡。目前发现AGR2在乳腺癌中高表达促进他莫昔芬及多柔比星耐受,但是在我们前期通过组学数据分析在多西紫杉醇耐药的前列腺癌细胞中AGR2表达显著下调。因此我们首先进行了通量的药物筛选以确定AGR2的表达与肿瘤化疗耐受的相关性,为进一步分析AGR2的功能提供基础。一、不同细胞AGR2的基础表达对化疗药物的敏感性对比通过对常见的肿瘤细胞AGR2基础表达进行分析,分别选取AGR2高表达和低表达的细胞进行药物敏感性筛选,发现AGR2的表达水平影响药物的药效:1.低表达AGR2的非小细胞肺癌与结肠癌细胞对化疗药物耐受WB实验结果显示非小细胞肺癌细胞A549中AGR2表达显著低于H460细胞,SW620中AGR2表达显著低于SW480。根据MTT结果分析其IC50值,结果表明低表达AGR2的A549与SW620细胞对多西紫杉醇、阿霉素及顺铂三种化疗药物较为耐受,而H460与SW480细胞对所选药物较为敏感,。2.高表达AGR2的乳腺癌细胞对细胞毒性化疗药物耐受WB实验显示乳腺癌细胞MDA-MB-453中AGR2表达显著高于MDA-MB-468细胞,MTT结果表明,MDA-MB-453细胞三种化疗药物较为耐受,而MDA-MB-468细胞对药物较为敏感。二、细胞沉默或过表达AGR2表达对化疗药物及靶向药物的应答分析1.细胞AGR2表达变化对化疗药物敏感性的影响我们在AGR2高表达的PC3,H460,SW480细胞中沉默AGR2表达,在AGR2低表达的DU145,A549,SW620中过表达AGR2后分析其对化疗药物敏感性的影响。MTT检测发现与对照细胞相比,AGR2表达下调后前列腺癌、非小细胞肺癌及结肠腺癌细胞对化疗药物多西紫杉醇、阿霉素及顺铂产生耐受,过表达AGR2后三种肿瘤细胞对药物敏感性增加,和前期数据一致。2.细胞AGR2表达改变对靶向药物敏感性的影响MTT检测发现与对照细胞相比,AGR2表达下调后前列腺癌、非小细胞肺癌及结肠腺癌细胞对EGFR靶向药物吉非替尼、CDK4/6靶向药物帕布昔利布及血管新生靶向药物卡博替尼耐受,对蛋白酶体靶向药物硼替佐米敏感。过表达AGR2后三种肿瘤细胞对吉非替尼,帕布昔利布及卡博替尼敏感,对硼替佐米耐受。3.乳腺癌细胞AGR2表达与化疗药物敏感性筛选:MTT检测发现与对照细胞相比,AGR2表达下调后乳腺癌细胞MDA-MB-453细胞毒性化疗药物多西紫杉醇、阿霉素及CDK4/6靶向药物帕布昔利布、血管新生靶向药物卡博替尼以及蛋白酶体靶向药物硼替佐米一致敏感。过表达AGR2的MDA-MB-468细胞对筛选的五种化疗药物一致耐受。第二部分分泌AGR2拮抗抗血管新生靶向药物的分子机制及应对方案在第一部分通量筛选中,我们发现AGR2高表达肿瘤细胞对抗血管新生药物卡博替尼耐受,这引起了我们的兴趣。肿瘤增殖与侵袭转移均需要充足的营养供给,这促使肿瘤组织血管新生以保重营养物质和氧气输送,运出代谢产物并为至肿瘤转移提供重要的门户。虽然AGR2在肿瘤增殖与侵袭中研究较多,但是AGR2对抗血管新生靶向药物的影响是否与促进血管新生有关尚无报道。课题组前期发现AGR2能够显著促进原位前列腺癌的侵袭转移,并且过表达AGR2的原位肿瘤血运尤为丰富,提示AGR2促进肿瘤血管新生以促进前列腺癌侵袭转移。结合第一部分AGR2对抗血管新生药物敏感性的影响,本部分探讨AGR2促血管新生的分子机制及应对策略。一.分泌的AGR2协同VEGFA促进血管新生前期研究已证实,细胞内高表达的AGR2可通过稳定NF-κB介导的EMT机制而发挥促进肿瘤侵袭转移的作用。本论文进一步发现过表达AGR2的细胞上清同样具有显著的促进肿瘤增殖和迁移的作用,提示分泌的AGR2可能发挥促进肿瘤侵袭转移的作用,因此,本部分重点分析分泌的AGR2是否能够促进肿瘤侵袭转移与血管新生:1.重组人AGR2蛋白促进血管新生采用原核表达纯化体系获得了带His标签的重组人AGR2融合蛋白。分子筛结果显示蛋白为二聚体活性形式存在。细胞生长曲线数据表明重组人AGR2蛋白能够促进前列腺癌细胞增殖。小管形成实验表明rhAGR2显著增加内皮细胞HUVECs的小管形成数目。ELISA实验结果显示rhAGR2刺激后,HUVECs培养基中VEGFA含量无明显变化,提示AGR2不促进VEGFA的成熟。2.重组人AGR2蛋白协同VEGFA促进血管新生小管形成实验表明rhAGR2与VEGFA都能够增加HUVECs小管形成数目,二者联合刺激HUVECs小管形成数目显著高于单独刺激。划痕实验表明rhAGR2与VEGFA联合刺激增强HUVECs与前列腺癌细胞PC3的移动能力明显强于单独刺激。Q-PCR结果显示rhAGR2与VEGFA联合刺激增强VEGFR2信号通路。二.分泌的AGR2直接结合VEGFA,激活VEGF/VEGFR信号而促进血管新生1.AGR2与VEGFA直接相互作用采用原核表达纯化体系获得了带His标签的重组人VEGFA融合蛋白与GST标签的AGR2全场及截短体蛋白蛋白,SDS-PAGE表明蛋白正确且纯度较高。His-pulldown实验证实AGR2与VEGFA存在直接相互作用。通过VEGFA与AGR2截短体pulldown实验表明AGR2与VEGFA结合于AGR2的81-101位氨基酸内。2.AGR2与VEGFA形成分子间二硫键His-pulldown实验证实AGR2半胱氨酸突变体不能与VEGFA相互作用,并且还原剂阻断AGR2与VEGFA的相互作用。小管形成实验表明细胞分泌与纯化的AGR2 C81A突变体蛋白都不能促进HUVECs小管形成。因此PDI结构域是AGR2与其他蛋白形成分子间二硫键的关键结构域。3.还原剂谷胱甘肽阻断AGR2促血管新生与促侵袭活性免疫共沉淀实验表明生理性还原剂谷胱甘肽能够破坏细胞外AGR2与VEGFA相互作用。小管形成实验显示谷胱甘肽联合rhAGR2刺激HUVECs小管形成数目显著降低。划痕实验表明谷胱甘肽联合rhAGR2刺激PC3细胞转移能力显著下降。体内肿瘤侵袭转移模型发现谷胱甘肽能够降低注射rhAGR2小鼠肺转移灶数目,但是抗血管新生药物贝伐珠单抗则不能抑制注射rhAGR2小鼠肺转移灶数目。三、分泌的AGR2拮抗血管新生靶向药物及用药选择研究小管形成实验表明卡博替尼与贝伐珠单抗都可以有效的抑制HUVECs小管形成数目,但是rhAGR2不能逆转卡博替尼而可以逆转贝伐珠单抗抑制HUVECs小管形成数目。裸鼠荷瘤实验表明腹腔注射rhAGR2能够削弱贝伐珠单抗的抗肿瘤活性,而对卡博替尼的抗肿瘤活性没有影响。提示AGR2指示抗血管新生药物用药。第三部分AGR2低表达介导的肿瘤化疗多药耐药的分子机制在第一部分中,我们发现AGR2低表达介导了激素非依赖的前列腺癌,非小细胞肺癌及结肠腺癌的化疗耐受。而筛选结果表明,下调AGR2介导了癌细胞对多种结构不同靶点各异的化疗药物耐受,提示AGR2介导了肿瘤化疗多药耐药。因此我们探寻AGR2介导肿瘤化疗耐受的分子机制,以及克服耐药的用药策略。一、AGR2负调控MRP2表达介导肿瘤化疗多药耐药由于低水平的AGR2可介导多种不同结构和作用机制的化疗药物耐药,而药泵蛋白是介导多药耐药的重要机制,因此,首先分析药泵蛋白在AGR2低表达介导耐药的作用。流式细胞术结果显示PC3细胞下调AGR2,细胞内阿霉素的蓄积水平显著下降,表明药泵蛋白参与其耐药过程。MTT结果显示,AGR2在前列腺癌、非小细胞肺癌及结肠腺癌细胞中表达与P-gp不亲和的卡巴他赛药物敏感性呈负相关PC3与H460细胞中沉默AGR2表达,免疫印迹结果显示MRP2蛋白水平增加,免疫荧光结果显示过表达AGR2细胞膜上MRP2减少。提示AGR2介导MRP2依赖的多药耐药。二、ARRB1介导MRP2蛋白降解流式细胞术检测沉默ARRB1表达,细胞内阿霉素蓄积明显降低。WB结果显示,沉默ARRB1表达,MRP2蛋白表达升高,而过表达ARRB1,细胞MRP2蛋白表达降低。免疫共沉淀检测MRP2与同家族蛋白MRP1与ARRB1相互作用。蛋白泛素化检测发现过表达ARRB1,MRP2泛素化水平增加,并且ARRB1 S412D失活突变不能增加MRP2泛素化。最后免疫共沉淀结果显示MRP2与E3泛素连接酶MDM2相互作用。三、AGR2上调ARRB1介导肿瘤化疗多药耐药1.下调ARRB1介导肿瘤化疗多药耐药MTT结果显示PC3细胞与H460细胞沉默ARRB1表达,细胞对多西紫杉醇、阿霉素及顺铂等三种细胞毒性化疗药物耐受,而在DU145与A459细胞中过表达ARRB1,细胞对三种化疗药物敏感性增加。动物实验表明,下调ARRB1肿瘤对多西紫杉醇耐受。2.AGR2上调ARRB1蛋白表达介导药物耐受WB结果显示,H460细胞下调AGR2表达,ARRB1蛋白表达下降。免疫共沉淀结果显示,AGR2与ARRB1存在相互作用。MTT结果表明,过表达ARRB1逆转下调AGR2介导的肿瘤化疗耐受,而沉默ARRB1表达则逆转过表达AGR2介导的药物敏感。3.PDI结构域参与AGR2介导的药物耐受WB结果显示,PDI结构域突变的AGR2 C81A突变体不能上调ARRB1表达。MTT结果显示AGR2 C81A突变体不能影响肿瘤细胞对多西紫杉醇和阿霉素的敏感性。4.AGR2上调MRP2蛋白表达介导药物耐受MTT结果表明,在PC3与H460细胞中沉默MRP2表达逆转下调AGR2介导的药物敏感。第四部分蛋白酶体抑制剂克服AGR2低表达介导的肿瘤化疗多药耐药的作用及分子机制研究在前期通量筛选过程中,我们发现蛋白酶体抑制剂硼替佐米的药物敏感性与AGR2表达负相关,这提示我们靶向蛋白酶体有潜力作为AGR2低表达介导的肿瘤化疗多药耐药的应对策略。本部分分析AGR2调控蛋白酶体活性的机制,为肿瘤化疗耐受的逆转策略提供理论支持。一、AGR2负调控肿瘤细胞蛋白酶体活性1.AGR2与细胞泛素-蛋白酶体降解途径相关BioGRID数据库分析AGR2蛋白相互作用网络,聚类结果显示AGR2相互作用蛋白与蛋白质泛素化相关。WB结果显示沉默AGR2表达细胞内总泛素化蛋白减少,而过表达AGR2细胞内泛素化蛋白积累增加2.AGR2负调控蛋白酶体活性蛋白酶体活性分析结果表明,沉默AGR2表达,蛋白酶体中胰蛋白酶样活性、胰凝乳蛋白酶样活性与肽基-谷氨酰基水解酶样活性升高,而过表达AGR2,凝乳蛋白酶样活性与肽基-谷氨酰基水解酶样活性降低,胰蛋白酶样活性基本不变。二、AGR2调控蛋白酶体19s调节亚基与20s核心亚基结合11AGR2通过PDI结构域与19s蛋白酶体调节亚基结合蛋白酶体活性检测结果表明,与对照BSA蛋白相比,纯化的AGR2蛋白并不抑制蛋白酶体活性。免疫共沉淀表明,AGR2与19s调节亚基蛋白PSMD2存在相互作用,并且PDI结构域突变的AGR2 C81A不能与PSMD2相互作用,蛋白酶体活性检测提示AGR2 C81A不能抑制蛋白媒体活性。MTT检测细胞活力表明AGR2 C81A不能降低肿瘤细胞对蛋白酶体抑制剂硼替佐米的敏感性2.AGR2抑制19s调节亚基与20s核心亚基结合免疫共沉淀结果表明过表达AGR2,PSMD2与AGR2结合增多,而与核心亚基蛋白PSMA7结合减少。提示AGR2高表达抑制了 19s调节亚基与20s核心亚基结合从而蛋白酶体活性降低。三、多西紫杉醇与硼替佐米序惯性用药克服化疗获得性耐受动物实验数据显示,下调AGR2介导肿瘤细胞对多西紫杉醇耐受,对蛋白酶体抑制剂敏感。多西紫杉醇通过下调AGR2反馈性增加蛋白酶体活性。MTT结果显示,先采用多西紫杉醇处理12h后更换硼替佐米处理12h,肿瘤细胞存活率显著低于单独使用多西紫杉醇与硼替佐米或二者联用。动物实验表明先采用多西紫杉醇治疗后使用硼替佐米治疗的效果优于单独使用多西紫杉醇与硼替佐米或二者联用治疗效果。结论1.低表达AGR2与肿瘤细胞多药耐药相关。2.AGR2协同VEGFA促进肿瘤血管新生及贝伐珠单抗耐受,而谷胱甘肽与卡博替尼可以作为应对策略。3.低表达AGR2通过下调ARRB1的表达介导肿瘤化疗耐受4.AGR2通过抑制蛋白酶体核心亚基与调节亚基的结合负调控蛋白酶体。6.硼替佐米克服低表达AGR2介导的肿瘤多药耐药,并且多西紫杉醇与硼替佐米序惯性用药克服临床化疗获得性耐受创新点1.鉴定VEGFA是分泌AGR2的直接相互作用蛋白2.首次报道ARRB1介导了MRP2的降解起始,并且E3泛素连接酶MDM2介导了MRP2的泛素化。3.首次鉴定PSMD2是AGR2的相互作用蛋白,并且AGR2通过抑制蛋白酶体核心亚基与调节亚基的结合4.首次提出多西紫杉醇与硼替佐米序惯性用药方案,并且提出AGR2作为指示标志物指导临床肿瘤化疗用药。不足之处1.未能分析乳腺癌细胞中AGR2上调介导多药耐药的分子机制2.AGR2促进MRP2降解的机制研究不够完整,应当更进一步分析MRP2降解过程中AGR2所起到的作用。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R96
【部分图文】：

ＡＧＲ２表达高而ＤＵ１４５细胞ＡＧＲ２表达低，因此我们采用携带ＡＧＲ２干扰ＲＮＡ逡逑序列的腺病毒感染ＰＣ３细胞以下调ＡＧＲ２，在ＤＵ１４５细胞中转染ＡＧＲ２表达质逡逑粒以上调ＡＧＲ２表达。之后对多西紫杉醇细胞存活筛选。如图１．３，结果显示ＰＣ３逡逑细胞下调ＡＧＲ２，对多西紫杉醇敏感性随之下降。ＤＵ１４５细胞则与之相反。ＤＵ１４５逡逑细胞上调ＡＧＲ２，对多西紫杉醇敏感性上升。非小细胞肺癌结果与激素非依赖前逡逑列腺癌相似。在ＡＧＲ２低表达的ＮＳＣＬＣ细胞Ａ５４９中上调ＡＧＲ２表达，结果显逡逑示细胞对多西紫杉醇敏感性上升，而Ｈ４６０细胞下调ＡＧＲ２表达，对多西紫杉醇逡逑４８逡逑

１邋ｌｉ邋１１１逡逑ＭＤＡ－ＭＢ－ＩＳ３ＭＤＡ－ＭＢ－４ｂ８逦ＭＤＡ－ＭＢ－＊５３ＭＤＡ－ＭＢ－？６８逡逑ＤＯＸ邋１０ｕｇ／ｍｌ逦ＤＯＸ１０ｕ0／ｍｌ逡逑图１．２乳腺癌细胞内源细胞ＡＧＲ２表达与药物敏感相关性。Ａ．邋ＷＢ检测乳腺癌逡逑细胞ＡＧＲ２蛋白表达水平。Ｂ．乳腺癌细胞对细胞毒性化疗药物敏感性对比。（ｎ＝３，逡逑ｎｓ邋ｐ＞０．０５，邋＊ｐ＜０．０５，邋＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００１）逡逑２．肿瘤细胞上下调ＡＧＲ２与化疗药物敏感性差异筛选逡逑上一步筛选我们发现在激素非依赖前列腺癌，非小细胞肺癌及结肠腺癌细胞逡逑中高表达ＡＧＲ２的细胞株对多西紫杉醇，阿霉素及顺铂等三种细胞毒性化疗药逡逑物敏感耐受，低表达细胞株与之相反。而在三阴性乳腺癌细胞中，ＡＧＲ２高表达逡逑细胞株对化疗药物全线耐受。我们进一步上下调肿瘤细胞ＡＧＲ２表达，检测细胞逡逑对化疗药物耐受情况，首先是多西紫杉醇。我们课题组前期以报道ＰＣ３细胞逡逑ＡＧＲ２表达高而ＤＵ１４５细胞ＡＧＲ２表达低

逡逑阿霉素结果与多西紫杉醇相似。如图１．４，在ＡＧＲ２低表达的ＤＵ１４５，Ａ５４９，逡逑ＳＷ６２０细胞中上调ＡＧＲ２表达，结果显示细胞对阿霉素的敏感性上升，而ＡＧＲ２逡逑高表达的ＰＣ３，Ｈ４６０，邋ＳＷ６２０细胞下调ＡＧＲ２表达，细胞对阿霉素药物敏感性下逡逑降。乳腺癌细胞依旧得到了相反的结果。逡逑５ｕｇ／ｍｌ逦１０ｕｇ／ｍｔ逦５ｕｇ／ｍｌ逦１０ｕｇ／ｍｌ逡逑ｐ。遍输－煖偷逡逑ＭＣＩ邋ＡＯＲ７Ｉ逦ＭＣ？邋Ａ邋ＯＨＭ逦ｐｃＯＮＡ邋ｐｃＡＯＨ＞逦ｐ＜ＯＭＡ邋ｐｃＡＯＩ＊７逡逑ＯＯＫ？ｕ0ｎＭ逦ＯＯＸ１０ｕ0＞ｆＴｉｌ逦ＡＭ９逦ＡＭ＊逡逑ＮＯ逦Ａ（Ｈｍ逦ＭＯ逦ｐｃＯＮＡ邋ｐｃＡＯＲ７逦ｐｃＤＮＡ邋ｐｃＡＣＲ？逡逑－ｉｆｌ破—ｉｆｌvR逡逑ＯＯＸＷ＾逦ＤＯＸＩＯｕ＾ｍｌ逦ＰＣＡＯＩＭ逦ＰＣＯＮＡ邋ＰｃＡＯＲ？逡逑ＯＯＸ邋Ｓｕｏｆｍｌ逦ＤＯＸ邋１０ｕａ／ｎＫ逡逑ＭＢ４ＳＳ逦ＨＢ４？＞逦ＭＢ４Ｃ８逦ＭＢ４Ｍ逡逑ａ？－ｌ邋Ｉ逦：逦１逦Ｉ逦：逦１逦。＿＊｜逡逑ＭＤＡ－ＭＢ￣４５３！＊．‘ｊ＿邋■逦ｆ°‘ｊ＿邋■邋ＭＤＡ－ＭＢ￣４６８邋ｆ■邋ｉ－邋■逡逑＂ｉｍｍ邋：１Ｕ邋：ｍｍ邋：；Ｕ逡逑图１．４激素非依赖前列腺癌，非小细胞肺癌，结肠腺及乳腺癌细胞中沉默或逡逑过表达ＡＧＲ２，检测细胞对多柔比星的敏感性。（ｎ＝３，ｎｓｐ＞０．０５，邋＊ｐ＜０．０５，逡逑＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００１）逡逑我们在顺柏筛选中也得到了相似的结果。如图１．５邋ＡＧＲ２高表达细胞感染腺逡逑病毒之后细胞对顺铂的敏感性下降。在ＡＧＲ２低表达细胞中过表达ＡＧＲ２介导逡逑了细胞对顺铂的药物耐

本文编号：2830114