马度霉素抑制Akt介导自噬流阻断促使骨骼肌细胞凋亡分子机理研究

发布时间：2020-09-30 09:14

　　本文运用MDC、DAPI染色、RNA干扰、荧光标记、Western Blot分析等细胞分子生物学技术和方法,以C2C12和L6细胞为实验对象,综合研究了马度霉素诱导骨骼肌凋亡与自噬流阻断的关系,较为深入解析了 Akt信号在马度霉素诱导自噬流阻断导致骨骼肌细胞凋亡中的作用及其机理。结果如下:1马度霉素诱导骨骼肌细胞自噬体积累和自噬流阻断C2C12和L6细胞或感染Ad-GFP-LC3的C2C12和L6细胞,用0、0.05、0.1、0.2、0.5、1 μM马度霉素处理24 h后,MDC染色分析荧光强度,Western blot分析LC3-Ⅱ和p62蛋白表达,荧光拍照和定量统计GFP-LC3 puncta变化;使用重组腺病毒表达串联 m-Cherry-GFP-LC3(Ad-mCherry-GFP-LC3)感染 C2C12和L6细胞分析马度霉素(0、0.5、1μM)诱导自噬流表现。结果显示:马度霉素引起C2C12和L6细胞MDC荧光强度增强,GFP-LC3puncta增多;马度霉素以浓度依赖的方式引起LC3-Ⅱ和p62蛋白表达升高;马度霉素可以引发细胞内更多mCherry和GFP-LC3共定位。提示:马度霉素诱导骨骼肌细胞自噬体积累和自噬流阻断。2马度霉素阻断骨骼肌细胞自噬流引发凋亡使用自噬抑制剂CQ和自噬诱导剂雷帕霉素分析马度霉素诱导自噬体积累和自噬流阻断在凋亡中的作用。结果显示,CQ强化马度霉素诱导自噬流阻断致细胞凋亡增加,雷帕霉素改善马度霉素诱导自噬流阻断,进而保护骨骼肌细胞抗凋亡。提示:马度霉素阻断骨骼肌细胞自噬流引发凋亡。3马度霉素抑制Akt介导自噬流阻断致骨骼肌细胞凋亡采用Western Blot分析马度霉素处理骨骼肌细胞的Akt和GSK3β磷酸化变化;Akt抑制剂抑制Akt活性以及腺病毒持续激活Akt(Ad-myr-Akt)活性,观察细胞GFP-LC3 puncta数量、细胞活性、自噬流及凋亡表现。结果显示:马度霉素抑制Akt和GSK3β磷酸化;Akt抑制剂强化马度霉素诱导GFP-LC3 puncta增加及细胞活性降低和凋亡增加,且LC3-Ⅱ和p62、Cleaved-caspase-3表达也进一步增强;持续激活Akt削弱马度霉素诱导以上事件。提示:马度霉素抑制Akt介导自噬流阻断致骨骼肌细胞凋亡。
【学位单位】：南京师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R99
【部分图文】：

自噬,自噬体

将包裹物完全与外界隔离形成双层膜细胞器自噬体，自噬体携带货物运输到溶酶逡逑体并与之融合，最后溶酶体发挥降解功能并释放最终产物氨基酸等供细胞重新利逡逑用［１（）］。研究者将此动态过程称为自噬流（Ａｕｔｏｐｈａｇｉｃ邋ｆｌｕｘ）邋［１１］，图２－１为自噬流逡逑Ｐｌａｓｍａ逡逑＾邋ｍｅｍｂｒａｎｅ逡逑ｚ逦Ｌｙｓｏｓｏｍｅ邋Ｔ邋Ｔ逡逑Ａｕｔｏｐｈａｇｏｓｏｍｅ邋１逡逑Ｃ＇＼0Ｃ＾逦Ｍａｃｒｏａｕｔｏｐｈａｇｙ：邋ｎｏｍｉａｌ邋ｆｌｕｘ逦、0逡逑＾邋0逦‘逦Ａｕｔｏｌｙｓｏｓｏｍｃ逡逑Ｃｙｔｏｐｌａｓｍ逡逑图２－１自噬流通畅［１２］逡逑＾Ｐｌａｓｍａ＾＇＇＇＇＇逡逑Ｍａｃｒｏａｕｔｏｐｈａｇｙ：邋ｂｌｏｃｋ邋ｉｎ邋ｆｌｕｘ邋ｍｅｍ＾ｒａｎ＾邋＿＾逡逑Ａｕｔｏｐｈａｇｏｓｏｍｅ逦／＼逡逑Ｐｈａｇｏｐｈｏｒｅ逡逑Ｉｄ＃擺邋Ｉ逡逑图２－２自噬流阻断［１２］逡逑

自噬,流阻,自噬体

自噬,雷帕霉素,凋亡,莫能菌素

源性还是外源性的凋亡刺激因素都会导致Ｃａｓｐａｓｅ介导的Ｂｅｃｌｉｎ邋１裂解，裂解后逡逑的Ｂｅｃｌｉｎｌ会定位至线粒体，加重细胞凋亡，此外ｐ５３、ＤＡＰＡ、ｍＴＯＲ都是自噬逡逑与凋亡的交叉作用的信号途径，具体如图２－３所示［４３］。逡逑３聚醚类离子载体抗生素与自噬逡逑常见的聚醚类离子载体抗生素主要有马度霉素、莫能菌素以及盐霉素。关于逡逑马度霉素与自噬的报道寥寥无几，己有研究发现马度霉素通过阻断自噬流诱导心逡逑肌细胞发生死亡［４４］，而关于莫能菌素与自噻的报道也是屈指可数，关于莫能菌素逡逑与自嗤的报道是在１９８６年，研宄者Ｒｏｇａｎ等在细粒棘球绦虫的原核细胞观察到逡逑莫能菌素引起的自噬［４５］，随后在２０１２年在弓形虫中发现自噬作为莫能菌素的死逡逑亡诱导机制［４６］，２０１３年发现肺癌细胞中莫能菌素诱导的自噬抑制能够增强细胞逡逑

【参考文献】